干货！荧光成像标记指南手册来了

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活体动物发光和成像技术是用于生物医学研究中实时观察和检测活体动物体内的非侵入性成像方法，而使用合适的荧光染料标记则是细胞及组织荧光成像中的关键。T仔今天就给大家简要介绍一下荧光成像~

活体动物体内光学成像通常采用生物发光(bioluminescence)与荧光(fluorescence)两种技术。

生物发光技术通常使用生物发光基因，如荧光素酶基因（Luciferase），将其插入目标细胞或动物基因组中，这些基因表达的酶会催化底物（如荧光素luciferin），产生光信号。而荧光技术则利用荧光分子的特性，这些分子在吸收特定波长的光后，会发射出另一波长的光。

什么是荧光成像技术？

荧光是一种光致发光现象。当某种物质经某种波长的入射光照射，吸收光能后进入激发态，并且立即退激发并发出出射光（通常波长比入射光的波长，在可见光波段）；而且一旦停止入射光，发光现象也随之立即消失。有这性质的出射光就称为荧光。

荧光成像（Fluorescence Imaging，FLI）利用荧光分子的特性，通过荧光探针（如荧光染料、量子点）或内源性荧光蛋白（如GFP, RFP）进行标记后实现。

技术原理

荧光是通过激发光激发荧光基团达到高能量状态，而后产生发射光。与生物发光是一种自发光现象不同，所有荧光探针成像均需要外源激发光的激发。由于红光的穿透性效率在体内比蓝绿光的穿透性效率更高，因此近红外荧光（NIR）也是成像观察的优秀选择。

活体荧光成像技术主要有三类标记方法：

采用荧光蛋白（GFP、RFP等）进行标记：通过转基因方法将荧光蛋白基因插入目标对象的基因组中，使改基因在目标对象中表达。
采用荧光染料进行标记：常用的荧光染料有Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5及Cy7等。
采用量子点标记：量子点（Quantum dots,QDs），一种发光纳米晶体，具有连续吸收光谱、窄发射光谱、高稳定性等独特发光特性和电子特性。

荧光成像是增强生物诊断和图像引导手术的基本研究和治疗应用中的重要成像方法之一。与传统成像方法，如CT、NMRI和PET等相比，荧光成像具有实时成像、节约成本、非侵入性以及高空间和时间分辨率等优点。

常用的荧光染料

理想情况下，荧光染料应具有以下特点：不改变靶分子/细胞的整体形状和功能；定位于细胞/分子的靶位置；即使在存在其他分子的情况下，也保持高特异性；在可见光波长范围内工作

常用有机染料包括菁染料(Cyanine，Cy) 、荧光素、异硫氰酸荧光素（FITC）、俄勒冈绿、和羧基荧光素、罗丹明荧光染料 等。下面给大家详细介绍一下菁染料。

菁染料可以与感兴趣的蛋白质/抗体结合，生成靶向重组荧光探针，在不同的动物模型中结合并追踪感兴趣的蛋白质/细胞，此外，它们也 常用于生物筛选，蛋白免疫印迹，生物医学显影，小动物体内成像等。菁染料分为两大类——

非磺化菁染料

非磺化菁染料，包括Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7和Cy7.5，这些染料大多具有低水溶性。它们在进行生物分子标记时，通常先溶解在有机溶剂中，然后再加入含有生物分子的溶液中。其中Cy3， Cy5和Cy7的发色团是indolenine，而Cy3.5， Cy5.5和Cy7.5的是Benzoindole（Cy代表“花菁”，数字表示吲哚基之间的碳原子数，添加后缀.5表示苯并稠合的花菁）。

磺化菁染料

磺化氰染料包括sulfo-Cy3、sulfo-Cy3.5、sulfo-Cy5、sulfo-Cy5.5、sulfo-Cy7和sulfo-Cy7.5。顾名思义，这些氰染料的特点是含有磺基，这有助于染料分子在水相中的溶解。与非磺化氰染料相比更具水溶性，因此在标记时不需要溶解在有机溶剂中。

磺化氰染料通常用于标记水溶液中的疏水蛋白质、纳米颗粒以及可能被DMSO或DMF等有机溶剂变性的敏感蛋白质。

Cy3 简介

Cy3是一种呈橙色的花青素荧光染料。其荧在肉眼下很亮且对pH不敏感。在共聚焦显微镜中，它可以被532 nm(acromion) 或556 nm(peak) 激光束激发。在普通荧光显微镜中，可以通过TRITC（四甲基罗丹明）滤光片观察到它，因此可以在大多数荧光仪器中使用。Cy3.5 荧光稳定性相比Cy3有所提高。

Cy5 简介

Cy5是一种红色的花青素荧光染料。由于它的激发和发射峰都在长波长红光区，其高光稳定性和亮度使其适用于荧光共振能量转移（FRET）和多色荧光标记实验。相对于Cy3，Cy5具有明显的灵敏度优势。此外，它的荧光处在大多数仪器的检测范围内，所以它也是非常常见的荧光标记化合物。

Cy5.5 简介

Cy5.5是一种近红外花青素荧光染料，荧光波长恰好处于第一个体内成像窗口（该区域的背景荧光较弱，长波长光子穿透力强），在体内成像研究中应用广泛，特别是小动物成像。其长波长的荧光发射减少了生物组织的自发荧光背景，使其成为体内深层组织成像的理想选择。

Cy7 简介

Cy7是一种近红外花青素荧光染料。由于其荧光波长也恰好位于第一个体内成像窗口，常用于体内成像应用，如肿瘤成像和药物分布研究（比Cy5.5更灵敏）。Cy7的荧光肉眼不可见，因此在显微镜下观察时需要借助CCD摄像头在成像软件中显示。可用于标记核酸、蛋白质、抗体、肽、纳米粒子等。

Cy7.5 简介

Cy7.5是一种改良的近红外花青素荧光染料。因其更长的波长，使其在体内深层组织成像中的背景荧光更低，信号更清晰。适用于肿瘤、心血管疾病等体内研究，常常用于小动物体内分布追踪等体内成像实验。

总的来说，这两类染料都可以用于肽、寡核苷酸、DNA、抗体、可溶性蛋白质等生物分子的标记。欢迎私信T仔咨询详情哦~

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