RIPA Lysis Buffer (Strong)

RIPA裂解液的原理是利用其成分中的各种化学物质对细胞膜和核膜进行破坏，从而释放出细胞内的蛋白质和其他细胞成分。

1 裂解细胞或细菌酵母样品

融解RIPA裂解液，混匀。取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM，或者根据实验需要加入适当的蛋白酶磷酸酶抑制剂Cocktail。置于冰上操作。

1）对于贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗2遍(如果血清中的蛋白没有干扰，可以不洗)。按照6孔板每孔加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。用枪轻轻吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。冰上放置 5-10 分钟，期间可震荡 3-4 次，每次 30 秒，以充分裂解。

2）对于悬浮细胞：离心收集细胞，轻轻涡旋或者弹击管底以把细胞尽量分散开。按照6孔板每孔细胞加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液，轻弹管底以充分裂解细胞。充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。如果细胞量较多，需要分装成0.5-5 × 106cells/管，然后再裂解。冰上放置 5-10 分钟，期间可震荡 3-4 次，每次 30 秒，以充分裂解。

3）对于细菌或酵母：对于1ml菌液或酵母液，离心去上清，如果有必要可以使用PBS洗涤一次，充分去除液体后，轻轻涡旋或者弹击管底以把细菌或酵母尽量弹散。加入100-200μL裂解液，轻轻涡旋或者弹击管底以混匀，冰上裂解2-10min。如果希望获得更好的裂解效果，细菌和酵母可以分别使用溶菌酶和破壁酶消化，然后再使用本裂解液进行裂解。

4）充分裂解后，10000-14000g离心3-5分钟，取上清，即可进行后续的PAGE、Western、IP和Co-IP操作，也可用液氮速冻后放 –80°C 长期保存。

2 裂解组织样品

1）把组织剪切成细小的碎片。

2）融解RIPA裂解液，混匀。取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM，或者根据实验需要加入蛋白酶磷酸酶抑制剂抑制剂Cocktail。

3）按照每20mg组织加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。如果裂解不充分可以适当添加更多的裂解液，如果需要高浓度的蛋白样品，可以适当减少裂解液的用量。

4）用玻璃匀浆器冰上均质 30-50 次，或超声破碎细胞，每次 30 秒，3-4次，每次间隔 1 分钟，置于冰上冷却。均质或超声破碎细胞后应镜检，细胞破碎率不小于 90%，同时组织已经完全裂解，没有明显的小组织块。将匀浆物转移到离心管，冰上放置 5-10 分钟，期间震荡 3-4 次，每次 30 秒，以充分裂解。

5）充分裂解后，10000-14000g离心3-5分钟，取上清，即可进行后续的PAGE、Western、IP和Co-IP等操作。每20mg冻存的小鼠肝脏组织用200μL本裂解液裂解后获得的上清，其蛋白浓度约为15-25mg/ml，不同状态的不同组织有所不同。

-20℃ 1 年

1. 为取得最佳的使用效果，尽量避免过多的反复冻融。可以适当分装后使用。
2. 本品含有部分抑制剂可在一定程度上抑制蛋白降解，但不含PMSF以及蛋白酶磷酸酶抑制剂 Cocktail的全部成分，如有需求请自备。
3. 如果裂解组织样本，组织样品本身非常细小，可以适当剪切后直接加入裂解液裂解，通过强烈涡旋使样品裂解充分。然后离心取上清，用于后续实验。直接裂解的优点是比较方便，不必使用匀浆器或研磨设备，缺点是不如匀浆或研磨那样裂解比较充分。
4. 裂解样品的所有步骤都需要在冰上操作。
5. 裂解液中 SDS 4°C 保存易沉淀析出，使用前应该 37°C 水浴重新溶解完全后恢复到室温使用。
6. RIPA裂解缓冲液含有离子去污剂，如果待测定的激酶易变性，可能不适用。
7. 在制备用于磷酸酶测定的裂解物时，不要添加磷酸酶抑制剂。
8. RIPA裂解液提取得到的是全蛋白，包括核蛋白、浆蛋白、膜蛋白等。如果要提取特定的蛋白（如：核蛋白、膜蛋白）则可利用专门的蛋白提取试剂盒进行提取。
9. 如果IP的时候发现目的蛋白无法被 IP 下来，则说明裂解液的强度过强，可以使用较为温和的裂解液例如RIPA 裂解液（弱）。
10. 本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
11. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

• RIPA裂解液(强)说明书-中文(1.45 MB)