6-ROX (6-Carboxy-X-rhodamine) is a fluorescent oligonucleotide marker and acts as an acceptor molecule coupled to 5-FAM as the donor in FRET imaging with excitation of 514nm and emission of 525nm.

一、FRET 成像应用
6-ROX 常用于 FRET 实验中，作为供体荧光分子与受体 5-FAM 结合。6-ROX的浓度通常为 1–10 μM。此设置用于研究分子相互作用，如蛋白质-蛋白质相互作用、DNA 杂交及细胞过程。
1.材料准备：
(1) 6-ROX 标记的寡核苷酸： 6-ROX 通常与寡核苷酸的 5' 端结合或其他生物分子。
(2) 5-FAM 标记的寡核苷酸（或其他受体荧光分子）： 受体染料（如 5-FAM）与寡核苷酸的不同部位结合。
(3) FRET 缓冲液： 使用适当的缓冲液（如 PBS），并可加入 Mg²⁺ 或 NaCl 等添加剂，以保持杂交和 FRET 反应的最佳条件。
(4) 荧光光谱仪或 FRET 成像系统： 配备能够检测激发波长为 568 nm 和相应发射波长（通常 5-FAM 为 512 nm）的设备。
2. 步骤：
(1) 准备： 将 6-ROX 与寡核苷酸或目标分子结合。
(2) FRET 实验设置： 将 6-ROX 标记的寡核苷酸与 5-FAM 标记的寡核苷酸混合，确保它们处于足够接近的距离，以实现高效的能量转移。
(3) 激发和发射检测： 在 568 nm 激发下，检测 5-FAM 的发射信号（通常为 512 nm）。FRET 信号反映了供体（6-ROX）与受体（5-FAM）分子之间的接近程度。
(4) 数据分析： 分析 FRET 效率，该效率与供体和受体分子之间的相互作用成正比。能量转移越大，受体的荧光信号就越强。
二、 基因表达与定量： 6-ROX 也可用于实时 PCR 实验中，监测基因表达水平。6-ROX的浓度为 0.1–1 μM。它常用于多重标记实验，与其他荧光探针一起，能在同一样本中同时检测多个目标。
1. 材料准备：
(1) 6-ROX 标记的探针： 用作报告分子，在扩增过程中监测特定基因序列。
(2) PCR 引物和模板： 使用适当的引物和模板，靶向特定的基因序列。
(3) v实时 PCR 系统： 配备能够检测适当波长荧光信号的 PCR 设备。
2.步骤：
(1) 探针设计： 设计特异性强的 6-ROX 标记探针，使其与目标基因序列结合。
(2) PCR 扩增： 在实时 PCR 中，6-ROX 探针结合目标 DNA，在扩增过程中发出荧光并被检测。
(3) 定量分析： 通过测量荧光强度的变化，量化基因表达水平。