MitoSOX Red is a novel fluorescent probe that is specific and cell membrane-permeable and targets mitochondria in living cells.MitoSOX Red is oxidized by superoxide upon entry into the mitochondria and is not oxidized by other ROS or RNS-generating systems.MitoSOX Red then binds to nucleic acids in the mitochondrion and produces a strong red fluorescence.MitoSOX Red can be used as a fluorescent indicator for the specific detection of superoxide.MitoSOX Red can be used as a fluorescent indicator for the specific detection of superoxide. MitoSOX Red can be used as a fluorescent indicator to specifically detect superoxide. Superoxide dismutase (SOD) prevents the oxidation of MitoSOX Red.

一、溶液配置
1. MitoSOX Red 母液配置：MitoSOX Red 溶解在 DMSO 里，通常浓度为1-10mM，具体可以根据实验条件进行优化。
2.工作溶配置：将 MitoSOX Red stock 溶液稀释到适合实验的浓度。常见的最终浓度范围为 1 到 10 µM，但应根据细胞类型和实验条件进行优化。
3. 对照试剂：使用超氧化物歧化酶（SOD）作为负对照，因为 SOD 会清除超氧化物并防止 MitoSOX Red 的氧化。
二、细胞标记
1. 培养细胞：将细胞接种到适当的培养器皿（如培养皿或盖玻片）中，培养 24-48 小时，直至细胞充分附着和生长。
2. MitoSOX Red 染色：将工作浓度的 MitoSOX Red 添加到培养基中。在 37°C 下孵育 10 到 30 分钟，染色时间应根据细胞类型进行优化。
3. 洗涤：孵育结束后，用 PBS 彻底洗涤细胞，去除多余的 MitoSOX Red。
4. 荧光检测：
1）激发和发射波长：MitoSOX Red 的激发波长为 510 nm，发射波长为 580 nm。使用荧光显微镜或流式细胞仪，配备适当的滤光片来检测红色荧光。
2）超氧化物检测：红色荧光的强度与线粒体中的超氧化物水平成正比。荧光强度较高表明超氧化物水平较高，而低荧光则表明超氧化物水平较低。
5. 实验对照：
1）阳性对照：使用已知的氧化应激诱导物，如 Paraquat 或 Rotenone，来升高细胞内的超氧化物水平，从而增加 MitoSOX Red 的荧光。
2）阴性对照：加入 超氧化物歧化酶（SOD），防止超氧化物氧化 MitoSOX Red，从而减少或消除荧光。
6. 定量分析：
对于定量分析，可以使用流式细胞仪测量单个细胞的荧光强度，这有助于分析大量细胞中的超氧化物水平。也可以通过图像分析进行定性评估。
注意事项：
1. MitoSOX Red 对光敏感，因此在储存和操作过程中应避免暴露在光照下。
2. 该探针特异性靶向线粒体，仅会被超氧化物氧化，不会被其他 ROS 或 RNS 氧化，从而确保检测的特异性。
3. 在孵育过程中，确保细胞不会过度应激或受损，以免引起伪影或非特异性荧光。