CY5-SE (Cy5 NHS Ester) is a reactive dye used to label amino groups in peptides, proteins and nucleotides. It needs to be stored away from light. Excitation wavelength (nm): 640, emission wavelength (nm): 664.

将 1 mL 100 mM 碳酸氢钠缓冲液（pH 8.3）中的 100 μg/mL SELP 溶液与 10 μL 10%二甲亚砜中的 1.2 mg/mL Cy5 单 NHS-酯（CY5-SE）混合，冰浴 2 小时。并在冰上孵育 2 小时。为淬灭反应，向反应溶液中加入 50 μL 1 M Tris-HCl（pH 8.0）。为了计算 Cy5 和 SELP 在 Cy5 共轭的 SELP 中的摩尔浓度，在 37 °C 下将含有指定浓度的纯 SELP 和 BCA 溶液的反应进行 30 分钟。然后使用微孔板阅读器在 562 和 633 纳米波长处测定 SELP 和 Cy5 的吸光度。[1]

一、原液制备步骤
1. 蛋白准备
1)为实现最佳标记效果，需将蛋白（抗体）浓度调整至 2 mg/mL。
2)确保蛋白溶液的 pH 在 8.5±0.5 范围内。若 pH 值低于 8.0，可用 1 M 碳酸氢钠调节。
3)当蛋白浓度低于 2 mg/mL 时，标记效率将显著降低。为优化标记效果，建议蛋白浓度维持在 2-10 mg/mL 之间。
4)蛋白需溶解在不含伯胺（如 Tris 或甘氨酸）和铵离子的缓冲液中，否则会干扰标记反应。
2. 染料准备
使用无水 DMSO 配制CY5-SE 染料，浓度为 10 mM 的储备液。通过玻璃棒或涡旋混匀。
注意：CY5-SE 染料储备液建议分装后避光保存于 -20 ℃ 或 -80 ℃。在后续标记实验前，需用 500 μg/mL 的缩合液（EDC hydrochloride T19947）进行活化。
3. 染料工作液用量计算
CY5-SE 染料的使用量根据标记蛋白的量决定。CY5-SE染料与蛋白的最佳摩尔比约为 10。
示例：需标记 500 μL、2 mg/mL 的 IgG（MW = 150,000）。假设用 100 μL DMSO 溶解 1 mg CY 染料，则计算如下：
1) IgG (mmol) = IgG (mg/mL) ×IgG (mL) / IgG (MW) =2 mg/mL×0.5 mL / 150000 mg/mmol= 6.7×10^6 mmol
2) CY5-SE (mmol) = IgG (mmol) ×10 =6.7×10^6 mmol×10 = 6.7×10^5 mmol
3) CY5-SE (μL) = CY5-SE(mmol)×CY5-SE(MW)/mg/CY5-SE (μL) = 6.7×10^5 mmol× 753.88.06 g/mol / 0.01 mg/μL
二、标记反应
1) 按计算量取用新鲜配制的 10 mM的 CY5-SE 染料母液（约 10 μL）并加入 50 μL 500 μg/mL 缩合液进行活化。将此混合液缓慢加入 0.5 mL 蛋白样品溶液中，轻轻混匀并短暂离心，使样品沉至反应管底部。避免剧烈摇晃，以免蛋白变性或失活。
2) 将反应管置于避光环境下，在室温条件下轻轻摇晃孵育 60 分钟。每隔 10-15 分钟，轻轻翻转反应管数次，以确保充分混合，提高标记效率。