流式细胞术是一种利用流式细胞仪对快速流动的细胞或颗粒进行多参数分析的技术，能够对细胞表面和内部的蛋白质、DNA、RNA等进行定量检测和分类，同时可实现细胞的分选。

流式抗体（FACS Antibody）是专为流式细胞术设计的抗体，用于检测和分析细胞表面或内部的特定蛋白质。这些抗体通常带有荧光标记，流式细胞仪通过检测其发出的荧光信号来识别并分析细胞特征（如图1）。流式细胞术可使用直接标记（如FITC、PE、APC等）的抗体进行检测，或通过未标记抗体进行间接检测。

▲图1：流式抗体的工作原理示意图

流式抗体的特点：

1）荧光标记：流式抗体通常结合荧光染料，如FITC 、PE、APC 等，便于在流式细胞仪中检测目标抗原的表达水平。

2）高特异性和亲和力：抗体需对目标抗原高度特异，以确保流式检测中的精确性。

3）低非特异性结合：流式抗体通常经过优化，以减少非特异性结合，提高信噪比。

4）稳定性：流式抗体的荧光标记物应在实验条件下具有较高的稳定性，以保证信号不受环境光和样品处理的影响。

流式抗体的类型：

1）单克隆抗体：针对单一抗原表位，提供一致性高、特异性强的信号，是流式细胞术中的首选。

2）多克隆抗体：识别抗原的多个表位，信号强度较高，但特异性较单克隆抗体低，通常在特定应用中使用。

3）直接标记抗体：抗体直接结合荧光染料，用于单一染色，便于操作，信噪比较高。

4）间接标记抗体：使用未标记的抗体加上荧光标记的二抗，用于增加信号强度或在稀有抗体不足的情况下应用。

5）异型对照抗体：用作阴性对照，以确保信号特异性，排除非特异性结合的影响。

流式抗体的选择：

1）抗体的特异性和亲和力：根据目标抗原，选择已验证具有良好特异性和亲和力的抗体，以确保检测的准确性。

2）荧光染料的选择：根据多重染色实验的要求选择不同光谱的荧光染料，避免光谱重叠并优化信号检测。

3）抗体来源：选择与实验物种匹配的抗体来源，以减少交叉反应。

4）直接或间接标记：对于高表达抗原，直接标记抗体更简便；对于低表达抗原，间接标记抗体可提高信号。

5）适当的对照：包括异型对照、未染色对照、单染色对照等，以校正信号背景和优化数据分析。

6）选择合适的流式抗体能够显著提高实验的特异性、信噪比和数据准确性。

多色流式细胞术该如何进行配色？

流式细胞实验表面上是一个非常简单的试验，但是对于大多数新手来说，除了要慎重选择抗体之外，还要熟悉如何进行荧光配色，最大限度地减少对补偿和重叠的调整，这也是流式实验的重中之重。
大部分科研工作者对流式的应用还局限于四色以内分析，对于多色（6色以上）分析往往掌握不好，究其原因是染料搭配不合适，导致各染料之间干扰很大，结果很难分析。本文总结了流式多色染色荧光搭配的几点技巧以供参考：

技巧1：选择合适的目标 Marker并确定Marker 的表达位置

通过查阅相关文献，在试验之前需要确定好Marker以及Marker 之间的逻辑关系（圈门的父子关系，比如 T 细胞CD3 是「父」，而 CD4 或者 CD8 就是子」）。

对于细胞质或者细胞核的 Marker，需要对细胞进行固定破膜/破核膜。在做胞质或胞核 Marker 染色实验操作时，需要先染细胞表面 Marker，再对细胞进行固定破膜，最后对胞内或核内 Marker 染色。

一般来说，绝大部分 CD 分子指标，都是细胞表面指标；IL 白介系列、IFN-γ 、TNF-α 等，属于胞内指标；而最常见的核内染色指标是 Foxp3（如表）

技巧2：选择流式细胞仪能检测的染料

要充分了解流式细胞仪有哪些激光器，有哪些滤光片通道，充分利用仪器允许的全部荧光染料，尽量选用多激光激发。

如图2列出了流式细胞仪的激发器和每个激发器对应能检测的染料[1]。下图只是列出了每个激发器可能激发的染料，并未列出所有染料，并不是仪器配置了该激发器就一定能激发出对应的染料，还需要根据仪器的通道配置来选择，即每个激发器对应有哪些检测通道，而每个检测通道只能对应检测一种染料，但不同染料可能是由同一个检测通道来检测，那么这些染料我们称之为荧光对等染料，荧光对等染料是不能共用的。

▲图2：不同激发器可激发的荧光染料

技巧3.强弱互补

荧光染料亮度有强弱之分，抗原表达有高低区别，因此弱表达抗原应该选择强荧光染料，强表达抗原选择弱荧光染料，使染料的亮度与抗原密度匹配。通常，根据待测细胞类型中，相应抗原的表达量，可以粗略地将抗原分子分为三类[2]：

1）很容易鉴定、容易区分阴阳性细胞群、阴阳性峰明显分开的抗原。例如：CD3，CD4，CD19 等。

2）很容易鉴定、较高水平表达、经常连续性表达。例如：CD27，CD28，CD45RA, CD45RO 等。

3）低水平表达、激活性 Marker、未知但关键。例如：CD25，STAT5，Foxp3 等。

同样，弱表达抗原放在被干扰较小的检测通道，而强表达抗原放在对其他通道干扰较小的检测通道,比如FITC\ PE\ PE-Cy7\ APC这四色一起检测时，弱表达抗原应该搭配APC荧光染料标记的抗体；强表达的抗原最终染色的信号较强，容易对其他检测通道造成干扰，因此我们应该选择对其他通道干扰较小的荧光染料。

因抗原表达密度受细胞类型以及细胞活化程度的影响，所以在此无法详细列出各抗原的表达密度强弱。但荧光染料的强弱是固定的，荧光的强度与染色指数(Stain Index)有关，一般染色指数越高，荧光强度越好；染色指数较低，染色强度相对较差，通过染色指数可以直接比较出各个荧光染料的强度（如图3）。

▲图3：不同类型荧光染料的染色指数排行[3]

技巧4：表达互相排斥的抗原可以放在相互干扰较大的检测通道，共表达的抗原避免放在相互干扰的通道

表达相互排斥的抗原指的是两种抗原不会同时表达在一种细胞上，这两种抗原表达在两种细胞上（例如CD4和CD8），因此流式图上分群很明显，即使荧光染料之间干扰很大，也很容易通过补偿的调节避免干扰；

而共表达的抗原指的是这两种抗原表达在同一种细胞上（例如CD4和CD25），在流式图上我们是要分析双阳性的细胞比例，因此如果这两个抗体对应的荧光染料之间有干扰，则会对圈门结果造成干扰，影响分析的细胞比例。

当然，选择优质的特异性抗体是实验成功的根本保证。在设计多色流式 panel 时，重要的是要了解仪器的配置，以及如何最佳地组合多种荧光染料，以最大程度地减少光谱重叠、提高结果的准确性。

TargetMol 可为您提供多种靶点的流式抗体，可用于流式细胞荧光分选技术（FACS）、 ELISA、免疫印迹试验（Western Blot, WB）和免疫荧光(Immunofluorescence, IF)等多种实验。

TargetMol流式抗体产品

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TargetMol流式抗体产品优势

哺乳动物表达系统：

我们的抗原使用哺乳动物表达系统，能最大限度保留人源蛋白天然结构、功能以及翻译后修饰。

兔源单克隆重组抗体：

我们的抗体使用兔子为免疫载体，兔子具有成熟的免疫机制并且与人同源性低。兔源抗体具有亲和力强、灵敏度高、特异性强、多样性丰富等特点。此外，重组抗体的制备批次间差异小。

高稳定性：

产品均通过冻融稳定性和加速稳定性测试，具有优异的稳定性。

高覆盖度、多表位、多标记：

针对370+种人源蛋白兔单抗，每种抗原可提供多个潜在不同表位的抗体，系列抗体可以间接标记多种荧光蛋白（APC、PE等）或荧光小分子（AF488、AF555、AF647等）。

产品验证数据：

Flow cytometry on MV4-11 using anti CD47 (red) rabbit mAb and goat anti-rabbit IgG (H+L), BV405,control cells were stained only with BV405 (Blue)

参考资料：

[1]Cossarizza A, et,al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (second edition). Eur J Immunol. 2019 Oct;49(10):1457-1973. 

[2]Flores-Montero J,et,al. Fluorochrome choices for multi-color flow cytometry. J Immunol Methods. 2019 Dec;475:112618.

[3]Mair F,et,al. High-Dimensional Immunophenotyping with Fluorescence-Based Cytometry: A Practical Guidebook. Methods Mol Biol. 2019;2032:1-29.