EHT 1864 (EHT 1864 2HCl) is a Rac family GTPase inhibitor that blocks activation by direct binding to Rac1, Rac1b, Rac2, and Rac3 (Kd=40/50/60/250 nM). EHT 1864 inhibits Rac, Ras, and Tiam-induced growth transformation of NIH-3T3 fibroblasts.

Rac2:60 nM(Kd), Rac1:40 nM(Kd), Rac1b:50 nM(Kd), Rac3:250 nM(Kd)

方法: U87-MG 细胞用 EHT 1864 (10-25 µM) 处理 5 min，通过 pull-down 检测活化 Rac1 或 RhoA 的水平。
结果: EHT 1864 以剂量依赖的方式强烈抑制 Rac1 与其效应子 Pak1 相互作用的能力。相比之下，即使在最高测试剂量 (25 µM) 下，EHT 1864 也不会影响 RhoA 的激活状态。[1]
方法: 小鼠成纤维细胞 NIH 3T3 用 EHT 1864 (5 µM) 处理 4 h，然后用 PDGF、LPA 或 bradykinin 刺激培养物 15 min，然后固定，用 Alexa phalloidin 观察肌动蛋白丝。
结果: PDGF、LPA 和 bradykinin 分别有效诱导膜皱缩和 lamellipodia 形成、肌动蛋白应力纤维和丝状伪足。然而，在 EHT 1864 存在的情况下，虽然 LPA 和 bradykinin 仍然诱导了肌动蛋白细胞骨架组织的各自变化，但 PDGF 诱导的 lamellipodia 形成被完全阻断。EHT 1864 处理的细胞显示 PDGF 对 lamellipodia 的刺激减少了约 80%。[2]

方法: 为检测体内抗肿瘤活性，将 EHT 1864 (100 mg/kg) 腹腔注射给携带 BT-474 异种移植物的 NSG 小鼠，每天两次，持续两周。
结果: EHT 1864 显著减缓了肿瘤生长，平均每周生长率为 50% vs. 27%。EHT 1864 大大降低了 P-ERK1/2、P-AKT、P-p70S6K 和 P-Histone H3S10 (有丝分裂的标志物) 的水平。[3]

Inhibitor:GTPase binding analyses: For inhibitor:GTPase binding analyses, aliquots of small GTPase solution (containing 1 μM inhibitor) are titrated into a solution of 1 μM inhibitor in the cuvette. Changes in fluorescence anisotropy are monitored at λex = 360 nm, λem = 440 nm, 30 s after each addition. All data analysis and curve fitting were performed using Microsoft Excel and QuantumSoft's ProFit for Mac OS X.

NIH 3T3 cells stably expressing oncogenic Ras are plated in 96-well plates. The cells are cultured for up to 4 days in complete growth medium, either alone, or supplemented with 5 μM EHT 1864. Cell growth is then assessed using the conversion of MTT to a formazan product. Briefly, the MTT reagent (from a 5 mg/ml solution diluted in PBS) is added to the wells at a final concentration of 0.5 mg/ml, and the cells are further incubated for 4 h at 37°C. The medium is then removed, and the reaction is terminated by adding 100 μl/well Me2SO. The absorbance is read at 570 nm using a microplate reader.(Only for Reference)