3X HA Tag (Triple-HA Tag) is a bioactive peptide consisting of three repetitive HA tags (YPYDVPDYA) linked by peptide bonds and is mainly used for protein and peptide detection as well as facilitating functional analysis of target proteins. 3X HA Tag can be specifically recognized and conjugated to anti-HA tag antibody, and is widely used in Western blot, immunofluorescence, immunoprecipitation and other experimental techniques.

3X HA Tag 常用于融合蛋白的 Western blot 和免疫荧光检测，下面以 pCDNA3-VAMP8-3xHA为例，介绍下实验的操作步骤：
一、接种细胞
1.在 24 孔板的每孔中加入总共 1.5 × 10^4 个细胞.
2.移至 37 °C 培养箱中过夜。
二、使用 JetPrime 转染 HeLa 细胞
1.从每个孔中取出培养基，用 0.5 ml 完整的 DMEM 替换。
2.加入 500 ng pCDNA3-VAMP8-3xHA，并用 JetPrime 缓冲液调节至终体积为 100 μl。
3.室温下孵育 10 -15分钟。
4.每孔加入 15 μl 转染混合物。
5.在 37 °C 下在组织培养箱中孵育 6 小时。
6.取出培养基并更换为 1.5 ml 完整的 DMEM。
7.在 37 °C 组织培养箱中孵育过夜。
三、VAMP8 内吞摄取测定
1.用 1 ml 冰冷的 DMEM 洗涤转染的细胞。再重复一次，总共洗涤两次。
2.在冰冷的完全 DMEM 中稀释兔抗 HA 抗体，最终稀释度为 1：200。
向每个孔中加入 150 μl 稀释的抗 HA 抗体。
3.在冰上孵育 60 分钟，偶尔摇晃。
4.用 1 ml 冰冷的完整 DMEM 洗涤细胞 3 次。
5.用 1 ml 预热的 EBSS （37 °C） 洗涤细胞两次。
6.向每个孔中加入 1 ml 预热的 EBSS，并在 37 °C 组织培养箱中孵育 15、45 和 90 分钟。
三、免疫荧光
1.在每个时间点，取下适当的盖玻片，并转移到含有 1 ml 1× PBS 的新 24 孔板的新孔中。
2.取出 1× PBS，并替换为 1 ml 4% 多聚甲醛溶液。
3.在室温下孵育 15 分钟。
4.去除 4% 多聚甲醛溶液，用 1 ml 1× PBS 洗涤 3 次。每次洗涤，在室温下孵育 5 分钟。
5.去除最后一次洗涤并在室温下在 1 ml 封闭缓冲液中封闭 1 小时。
6.在抗体孵育缓冲液中，将小鼠抗 Lamp1 或小鼠抗 EEA1 分别稀释至 1：100 或 1：1,000 的最终稀释度。
7.去除封闭缓冲液，用 100 μl 适当的稀释抗体替换，并在 4 °C下孵育。
8.去除稀释的抗体溶液，用 1 ml 1× PBS 洗涤 3 次。每次洗涤，在室温下孵育 5 分钟。
9.稀释 Alexa 偶联的二抗。在抗体稀释缓冲液中，将山羊抗小鼠 Alexa-488 和山羊抗兔 Alexa-546 稀释至 1：250 的最终稀释度。
10.去除洗涤液，加入 200 μl 稀释的二抗溶液，并在室温下避光孵育 1 小时，以尽量减少光漂白。
11.取出含二抗的溶液，用 1 ml 1× PBS 洗涤 3 次。每次洗涤，在室温下孵育 5 分钟。
12.加入 200 μl 含有 1 μg/ml DAPI 的 1× PBS，并在室温下孵育 5 分钟。
13.去除含 DAPI 的溶液，用 1 ml 1× PBS 洗涤两次。每次洗涤，在室温下孵育 5 分钟。
14.将 10 μl FluorSave 封固剂吸取在显微镜载玻片上。
15.在适当的共聚焦或宽场显微镜系统上成像。[2]