2,7-Dichlorodihydrofluorescein (DCFH) is a non-fluorescent probe that is oxidized by intracellular reactive oxygen species (ROS) to produce the highly fluorescent 2',7'-Dichlorofluorescein (DCF).DCFH is commonly used to assay the intracellular level of ROS, to detect ROS production and to analyze oxidative stress.

使用方法
一、溶液配置
1.母液配置：将 4.85 mg 2,7-Dichlorodihydrofluorescein 溶于 1 mL 二甲基亚砜 （DMSO） 中，制成 10 mM 储备液。
2.工作液的配置：在将其添加到孔中之前，用预热的 DMEM 将储备液稀释成 10 μM 工作溶液。
二、操作步骤
1. 细胞接种
在 24 孔板中每孔接种 2 ×10^5 个 HCT116 结直肠癌细胞，并将细胞在 Dulbecco 改良的 Eagle 培养基 （DMEM） 中在 37 °C 下维持过夜。
2. 2,7-Dichlorodihydrofluorescein 染色
1）去除含有药物的培养基并用 DMEM 洗涤一次。
2）向每个孔中加入 500 μL 2,7-Dichlorodihydrofluorescein 工作溶液，并在 37 °C 下孵育 30 分钟。
3）取出 2,7-Dichlorodihydrofluorescein 工作溶液，用 DMEM 洗涤一次，用 1× 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 洗涤 2次。
4）向每个孔中加入 500 μL 1× PBS。
3. 成像采集和强度测量
1）在荧光显微镜上使用绿色荧光蛋白 （GFP） 通道为每个孔拍摄具有代表性的荧光图像。
2）拍摄图像后，去除 PBS 并向每个孔中加入 200 μL 放射免疫沉淀测定 （RIPA） 缓冲液。
3）在冰上孵育 5 分钟，然后将细胞裂解物收集到 1.5 mL 试管中。
4）在 4 °C 下以 21,130 × g 离心 10 分钟。
5）将 100 μL 上清液转移到黑色 96 孔板中，并使用荧光酶标仪在 485 nm 的激发波长和 530 nm 的发射波长下测量荧光强度。
6）将 1 μL 上清液转移到含有 100 μL 1× 蛋白测定溶液的透明 96 孔板中，以使用 Bradford assay 测量蛋白质浓度。
7）用蛋白质浓度标准化荧光强度。