Streptavidin Agarose 6FF

• 生物素分子结合能力优秀
• 非特异性吸附极低
• 化学稳定性良好
• 适应广泛的实验条件

1. 缓冲液准备
以下为常用的缓冲液成分，使用前建议用 0.22 μm 或 0.45 um 滤膜过滤：
A. 生物素或生物素化物质的纯化
1)平衡/洗杂液：20 mM NaH2PO4，0.15 M NaCl，pH7.4
2)洗脱液：8 M盐酸胍，pH1.5
B.亚氨基生物素标签物质的纯化
1)平衡/洗杂液：50 mM 碳酸铵，0.5 M NaCl，pH10.0
2)洗脱液：50 mM 碳酸铵，0.5 M NaCl，pH4.0

2. 样品准备
1)在上柱之前，应确保样品溶液的离子强度和pH值适当。可以使用平衡液或洗杂液对血清样品、腹水或细胞培养液进行稀释，或者通过透析将样品与平衡液或洗杂液进行平衡处理。
2)为了减少杂质、提高蛋白纯化效率并防止柱子堵塞，建议在上样前对样品进行离心处理或使用0.22 μm或0.45 μm滤膜进行过滤。

3. 链霉亲和素琼脂糖 6FF装填
A. 重力柱的装填
1)选择合适规格的重力层析柱，装入下垫片，加入适量纯水以润洗柱管和垫片，然后关闭下出口。
2)将链霉亲和素琼脂糖 6FF充分混匀后，使用枪头吸取适量的悬液加入至重力柱中（介质实际体积占悬液的一半），打开下出口让保护液流尽。
3)加入适量纯水冲洗介质，待柱管中的液体通过重力流干后，关闭下出口。
4)装入已经润洗的上垫片，确保垫片与填料之间没有空隙，并保持水平。
5)装填完成的重力柱可以直接加入平衡液进行平衡。如果暂时不使用，可加入保护液并在2-8℃条件下保存。

B. 中压层析柱的装填
链霉亲和素琼脂糖 6FF广泛应用于工业纯化，因此常涉及各种中压色谱柱的填装。以下介绍了层析柱的装填方法。装柱前，需要根据层析柱的直径计算柱子的底面积，并根据所需的装柱高度计算所需的介质体积，计算公式为：V=1.15πr2h。
（V：所需凝胶的体积 mL。1.15：压缩系数。r：柱管半径 cm。h：柱子所需装填的高度 cm。）
注：所取的悬液体积应为介质体积的两倍，因为介质只占悬液总量的一半，另一半为保护液。

1)使用去离子水冲洗层析柱的底部筛板和接头，确保筛板上没有气泡，然后关闭柱底出口，并在柱底部留出1-2 cm的去离子水。
2)将介质悬液充分混合均匀，然后小心地将悬液连续倒入层析柱中。可以使用玻璃棒沿柱壁引导悬液以减少气泡的产生。
3)如果使用储液器，应立即在层析柱和储液器中加满水，将进样分配器放置在浆液表面，并连接至泵上，确保分配器或进样管中不会产生气泡。
4)打开层析柱底部出口，启动泵，使缓冲液按照设定的流速通过层析柱。最初应让缓冲液以较慢的流速流过柱子，然后逐渐增加到最终流速，以避免液压对柱床的冲击，确保柱床的均匀性。如果无法达到推荐的压力或流速，可使用泵的最大流速，这样仍能得到理想的装填效果。
注：在随后的色谱过程中，流速不应超过最大装柱流速的75%。
5)当柱床高度稳定后，在最终装柱流速下至少再通过3倍柱床体积的去离子水，并标记柱床高度。
6)关闭泵并关闭层析柱出口。
7)如果使用储液器，移除储液器，将分配器放回层析柱中。
8)将分配器推至标记的柱床高度处，允许装柱液进入分配器，然后锁紧分配器接头。
9)最后，将装填好的层析柱连接到泵或色谱系统中，开始平衡过程。如有需要，可重新调整分配器。

4. 样品纯化
A. 孵育法纯化
1)根据待纯化样品的量，将链霉亲和素琼脂糖 6FF充分混匀后，取适量加入离心管，1000 rpm离心1 min，弃去上清；也可以将其加入重力柱中，待保护液流尽。
2)向离心管中加入5倍介质体积的平衡液以清洗介质，1000 rpm离心1 min，弃去上清。如使用重力柱，直接在柱中清洗并流尽平衡液。此操作需重复两次以上。
3)加入样品，封闭离心管或重力柱，4°C振荡孵育2-4 h，或在37°C孵育30 min-2 h。
4)孵育结束后，1000 rpm离心1 min，弃去上清，或通过过滤收集介质。保留上清以作为流穿样用于电泳鉴定。
5)用5倍介质体积的洗杂液清洗介质，1000 rpm离心1 min，或在重力柱中过滤去除上清（注意不要吸到介质），重复3-5次，建议中途更换新的离心管。
6)加入3-5倍柱体积的洗脱液进行洗脱，室温孵育5 min，1000 rpm离心1 min，或通过重力柱收集洗脱液。可重复2-3次。

B. 重力柱法纯化
1)将装填好的链霉亲和素琼脂糖 6FF重力柱用5倍柱体积的平衡液进行平衡，使填料与目标蛋白的缓冲液体系相同，重复2-3次。
2)将样品加入已平衡的重力柱中，确保样品在柱中至少保留2 min，以确保与介质充分接触。收集流出液，可以反复上样以增加结合效率。
3)用10-15倍柱体积的洗杂液进行清洗，去除非特异性吸附的杂蛋白，并收集洗杂液。
4)使用5-10倍柱体积的洗脱液进行洗脱，分段收集洗脱液。每个柱体积收集一管，以检测洗脱效率，确保所有结合的目标蛋白被洗脱，同时获得高纯度和高浓度的蛋白。

C. 中压层析柱法纯化
链霉亲和素琼脂糖 6FF装填好后，可使用常规的中低压色谱系统进行纯化。
1)确保泵管道中注满去离子水。移除上塞，将层析柱连接至色谱系统，打开下出口，将预装柱接入系统并旋紧。
2)用3-5倍柱体积的去离子水冲洗柱内储存的缓冲液。
3)使用至少5倍柱床体积的平衡液平衡色谱柱。
4)使用泵或样品环上样。
注：如果样品粘度较高，即使上样体积较小，也可能导致层析柱出现较大反压。上样量不应超过柱子的结合能力。大体积样品可能会引起较大的反压，使进样器使用困难。
5)用洗杂液冲洗柱子，直至紫外吸收达到稳定的基线（通常需要至少10-15倍柱体积）。
6)使用5-10倍柱体积的洗脱液进行洗脱，收集洗脱液，即为目标蛋白组分。洗脱结束后，用平衡液冲洗5-10倍柱体积，再用纯水冲洗5-10倍柱体积，最后用20%乙醇冲洗2倍柱体积，置于2-8°C保存。

5. SDS-PAGE检测
使用SDS-PAGE对纯化过程中得到的样品（包括流出组分、洗杂组分和洗脱组分）以及原始样品进行检测，以评估纯化效果。

6. 填料清洗
链霉亲和素琼脂糖 6FF可以重复使用而无需再生处理，但随着非特异性结合蛋白的增多和蛋白聚集，可能会导致流速和结合载量的下降。此时可以按照以下方法对填料进行清洗：
1)为去除沉淀或变性物质，建议使用2倍柱体积的0.1 M NaOH、6 M盐酸胍或8 M尿素溶液进行清洗，随后立即用5倍柱体积的PBS（pH 7.4）清洗。
2)为去除因疏水性吸附而导致的非特异性吸附物质，可使用3-4倍柱体积的70%乙醇或2倍柱体积的1% Triton X-100清洗，随后立即用5倍柱体积的PBS（pH 7.4）清洗。

4℃，2年。

1. 避免冷冻本产品。
2. 在实验过程中，样本需要在 4°C 或放置在冰上进行操作。
3. 本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
4. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

• 链霉亲和素琼脂糖 6FF 说明书-中文(1.65 MB)