RFP Tag Agarose

• 使用的抗体与RFP具有极高的亲和力，能够高效捕获裂解上清中的RFP标签蛋白。
• 免疫沉淀后，通过SDS-PAGE检测，背景信号更干净，更利于鉴定蛋白相互作用。
• 琼脂糖基质具有低非特异性吸附和良好的兼容性，每毫升的载量超过1 mg，适合进行RFP融合蛋白的大规模纯化。

• 适用于天然RFP、RFP突变体及其融合蛋白的免疫沉淀、免疫共沉淀和亲和层析等实验。

1. 缓冲液准备
以下为常用的缓冲液成分，使用前建议用 0.22 μm 或 0.45 um 滤膜过滤：
1)平衡/洗杂液：50 mM Tris, 0.15 M NaCl, pH7.4
2)酸性洗脱液：0.1 M glycine HCl, pH3.0
3)中和液：1 M Tris-HCl, pH8.0
4)保存溶液：1×PBS，0.02% NaN3

2. 柱层析
1)将RFP Tag 琼脂糖凝胶装填入适当的层析柱，使用5倍柱体积的平衡液进行平衡，以确保填料处于与目标蛋白相同的缓冲条件下。
2)将样品加入到已经平衡好的琼脂糖凝胶中，并收集流出液。可以多次上样以提高结合效率。
3)用10-20倍柱体积的洗涤液清洗，去除非特异性吸附的杂蛋白，并收集洗涤液。
4)进行酸性洗脱，使用5倍柱体积的酸性洗脱液进行洗脱，随后在洗脱组分中添加洗脱体积十分之一的中和液，调节pH至7.0-8.0，并分管收集。
注：酸性洗脱后，填料需立即用平衡液平衡，琼脂糖凝胶在洗脱液中的停留时间不应超过20 min。
5)使用3倍柱体积的洗脱液进行清洗，然后用平衡液调整至中性。
6)用3倍柱体积的保存溶液进行平衡，保存于2-8℃。

3. 静态吸附
1)将适量的RFP Tag 琼脂糖凝胶胶加入层析柱中，流干保护液。随后用5倍柱体积的平衡液进行清洗。
2)将样品溶液加入填料中，在4℃或室温下震荡孵育至少30 min（避免使用磁力搅拌），以确保填料与样品溶液充分混合。
3)孵育结束后，进行离心（5000×g，1 min）或过滤，以收集填料。
4)将收集到的填料装入层析柱中，用平衡液清洗，直到紫外检测稳定。
5)使用酸性洗脱液进行洗脱。
6)参照2中的第5)和第6)步骤进行填料的再生和保存。

4. 免疫沉淀
1)取40 µL的RFP Tag 琼脂糖凝胶（柱体积20 µL）混合液，加入到1.5 mL的离心管中，5000×g离心1 min，吸去上清液。
2)向填料中加入0.5 mL的平衡液，轻轻悬浮填料（以确保填料处于与目标蛋白相同的缓冲体系中，保护蛋白），5000×g离心1 min，吸去上清液。此步骤重复一次。
3)将200-1000 µL的样品加入处理好的填料中，混合均匀。将离心管置于翻转混合仪中轻轻翻转，确保样品与填料充分接触和吸附，室温孵育至少1 h（对于易降解的蛋白，建议添加蛋白酶抑制剂，如C0001，并在2-8℃的层析柜中操作，也可以在冷库中进行）。5000×g离心1 min，吸去上清液，注意不要吸走填料。
4)洗杂：向填料中加入0.5 mL的洗杂液，悬浮填料并轻轻混匀。5000×g离心1 min，吸去上清液。此步骤重复三次，以确保去除非特异性吸附。
5)样品洗脱：根据后续检测的需要选择不同的洗脱方法。
a)酸性洗脱：加入100 µL的洗脱液，悬浮填料，室温孵育5 min。5000×g离心1 min，吸去上清液，避免吸到填料，随后用中和液中和。洗脱样品放置在4℃，长时间可储存于-20℃。
b)变性洗脱：每管中加入20 µL的SDS-PAGE Loading Buffer（自备），95℃加热5 min。5000×g离心1 min，收集上清液，进行SDS-PAGE检测。
注：变性洗脱后的琼脂糖凝胶不能重复使用。

4℃，2年。

1. 凝胶应保存在储存溶液中，防止干燥。
2. 在从保存管中取出琼脂糖凝胶之前，应充分震荡以确保均匀悬浮。操作过程中注意避免产生气泡。
3. 并非所有的RFP蛋白都能与RFP Tag 琼脂糖凝胶结合。本产品已验证能够结合Tag-RFP、turbo-RFP、DsRed、mRFP、mCherry、mOrange、mPlum、mRuby、mKate2和mRFPruby。
4. 纯化前建议通过Western Blot检测RFP标签融合蛋白表达情况。
5. DTT可能导致RFP抗体在凝胶上脱落，因此请避免使用含有DTT的细胞裂解液样品。
6. 本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
7. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。