Protein A/G Immunoprecipitation Kit

1. 非特异性吸附低：相较于当前国际免疫磁珠市场上同类产品，本品具有更多的抗体结合位点，使用量更少，并且非特异性结合率低，能够快速高效地进行免疫沉淀实验。
2. 高效率、高产量、低消耗：每毫升免疫沉淀磁珠结合 Human IgG 的能力可达到500 μg 以上，单个沉淀反应仅需25 μL 磁珠即可完成检测。
3. 操作灵活、简便：微米级磁珠提供了超大比表面积，显著缩短了抗体与抗原吸附所需的平衡时间，使抗体吸附过程在15 min内完成，抗原沉淀操作在30 min内完成。
4. 实验结果可靠、重复性高：简短的操作时间避免了长时间操作造成目标蛋白水解的风险，保证了目标蛋白的活性及蛋白复合物的完整性。

1. 抗原样品制备
建议根据抗原样品的不同来源选择适当的预处理方式，以便将待检测抗原释放到样品溶液中。
1)血清样品：如果目标蛋白丰度较高，建议用Binding Buffer将血清样品稀释至目标蛋白终浓度为10~100 µg/mL，置于冰上备用，或于-20℃长期保存。
2)悬浮细胞样品：在无菌条件下将PBS（10×）稀释为1×。离心收集细胞（4℃, 500 g, 10 min），弃上清后称重，按每毫克细胞50 µL的比例用1× PBS洗涤两次。然后按每毫克细胞5~10 µL的比例加入Binding Buffer，同时加入蛋白酶抑制剂（1 mM PMSF 或蛋白酶抑制剂Cocktail C0001），混匀后置于冰上孵育10 min。离心收集上清液（4℃, 14000 g, 10 min），置于冰上备用，或于-20℃长期保存。
3)贴壁细胞样品：吸去培养基，按每1.0×10^5个细胞150 µL的比例用1×PBS洗涤两次。用细胞刮刀收集细胞，置于1.5 mL EP管，按每1.0×10^5个细胞20~30 µL的比例加入Binding Buffer，同时加入蛋白酶抑制剂，混匀后置于冰上孵育10 min。离心收集上清液（4℃, 14000 g, 10 min），置于冰上备用，或于-20℃长期保存。
4)大肠杆菌样品：离心收集大肠杆菌（4℃, 12000 g, 2 min），弃上清后称重，按每克（湿重）菌体10 mL的比例用1×PBS洗涤两次。然后按每克（湿重）菌体5~10 mL的比例加入Binding Buffer，同时加入蛋白酶抑制剂，重悬菌体，超声裂解细胞，离心收集上清（4℃, 17000 g, 10 min），置于冰上备用，或于-20℃长期保存。
注：以上方法制备的抗原样品适用于进行IP和Co-IP实验，如需进行ChIP实验，请另参照相关实验说明（如CST #9003）。

2. 磁珠预处理
1)将免疫沉淀磁珠用漩涡振荡器振荡1 min，使磁珠重新悬浮，取25~50 µL磁珠悬液放入1.5 mL EP管中。
2)加入200 µL Binding Buffer进行洗涤，将EP管放入磁性分离器，静置1 min，进行磁性分离，吸去上清液，取下EP管。重复上述洗涤步骤一次。
3)加入200 µL Binding Buffer重悬磁珠备用。

3. 抗体结合反应
1)抗体工作液的制备：将抗体样品用Binding Buffer稀释至终浓度为5~50 µg/mL，制备成抗体工作液，置于冰上备用。
2)抗体吸附：将步骤2中预处理的磁珠悬液进行磁性分离，吸去上清液。加入200 µL抗体工作液，迅速重悬磁珠，在室温下使用翻转混合仪或手工轻轻翻转EP管混合15 min，然后进行磁性分离，收集上清液，置于冰上备用以供后续检测。
3)洗涤：向EP管中加入200 µL Binding Buffer进行洗涤，轻轻用移液器吹打使磁珠-抗体复合物均匀分散，然后进行磁性分离，吸去上清液，取下EP管。重复上述洗涤步骤一次。

4. 抗体交联反应（可选操作）
如需同时洗脱抗体和目标抗原复合物，请跳过本步骤，直接进行步骤5。本步骤适用于需要单独洗脱目标抗原的实验，推荐使用BS3作为交联剂。具体实验操作请参照该试剂的说明书。

5. 抗原沉淀反应
1)抗原吸附：加入200 µL步骤1中制备的抗原样品，用移液器轻轻吹打，使抗原与磁珠-抗体复合物均匀分散。在室温下使用翻转混合仪或手工轻轻翻转EP管混合10 min，以确保抗原与抗体充分结合。如结合力较弱，可在室温下孵育1 h，或在4℃下孵育过夜。
2)洗涤与转移：将上述完成抗原吸附的磁珠-抗体-抗原复合物进行磁性分离，收集上清液，置于冰上以备后续检测。向EP管中加入200 µL Washing Buffer进行洗涤，用移液器轻轻吹打，使磁珠-抗体-抗原复合物均匀分散，然后进行磁性分离，吸去上清液，取下EP管。重复洗涤两次。最后，加入200 µL Washing Buffer，将磁珠-抗体-抗原复合物悬液转移至新的1.5 mL EP管中，并进行磁性分离，吸去上清液，取下EP管。
注：抗原洗脱前，需将磁珠转移到新的EP管，以避免将管壁上非特异性吸附的蛋白一同洗脱。

6. 抗原洗脱
提供以下两种抗原洗脱方案，用户可根据后续检测的需要选择不同的洗脱方法。
1)变性洗脱法：此方法洗脱的样品适用于SDS-PAGE检测。向EP管中加入25 µL 1× SDS-PAGE Loading Buffer（自备），混合均匀，95℃加热5 min。然后进行磁性分离或者离心（室温，13000 g, 10 min），收集上清液，进行SDS-PAGE检测。
2)非变性洗脱法：此方法洗脱的样品保持原有的生物活性，可用于后续功能分析。向EP管中加入20 µL Elution Buffer，混合均匀，室温孵育10 min。然后进行磁性分离或者离心（室温，13000 g, 10 min），收集上清液至新的EP管，并立即加入1.0 µL Neutralization Buffer，将洗脱产物pH调节至中性，用于后续功能分析。

4℃，2年。

1. 避免冷冻磁珠。磁珠应保存在储存溶液中，防止干燥。
2. 为了减少磁珠的损失，每次磁性分离的时间不应少于1 min。
3. 在从磁珠保存管中取出磁珠之前，应充分震荡以确保均匀悬浮。操作过程中注意避免产生气泡。
4. 建议使用质量较好的移液器吸头和反应管，以避免因磁珠和溶液附着而造成损失。
5. 应在无菌条件下稀释PBS（10×），一旦发现溶液有污染，立即停止使用。
6. 为确保最佳实验效果，请选择特异性较强的抗体进行免疫沉淀反应。
7. 操作者可根据实际需求，利用抗体结合反应步骤和抗原结合反应步骤中收集的上清液，检测抗体、抗原与磁珠的结合情况。
8. 在IP实验中，不同类型的抗体和抗原结合的亲和力会有所不同。Binding Buffer和Washing Buffer也会影响抗体与抗原的结合效果。因此，如果使用本试剂盒提供的缓冲体系未能获得理想的实验结果，操作者可以自行筛选和配制缓冲液进行实验。
9. 虽然本磁珠表面包被的重组蛋白Protein A/G在极端条件下（如低pH、加热处理）几乎不会脱落，但仍不建议用于分子量约130 kDa目标蛋白的免疫沉淀实验。
10. 本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
11. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

• C0104-Protein A/G 免疫沉淀试剂盒说明书-中文(1.37 MB)