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规格 | 价格 | 库存 | 数量 |
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1 mL | ¥ 380 | 现货 | |
5 mL | ¥ 1,620 | 现货 |
Protein A/G 免疫沉淀磁珠 | 特性 |
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粒径 | 2 μm |
Human IgG 能力(Antibody Capacity) | 0.5~0.6 mg/mL |
磁珠浓度 | 10 mg/mL |
保存溶剂 | 1×PBS,含 0.1%(w/v)BSA,0.1%(V/V)proclin-300 |
适用抗体种属 | 广谱抗体种属 |
应用推荐 | IP, Co-IP, ChIP |
试剂 | 可选配方 |
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结合缓冲液 Binding Buffer | 1×PBS, 1%(v/v)TritonX-100, 0.01%(v/v) NP-40, 5%(v/v) Glycerol |
洗涤缓冲液 Washing Buffer | 50 mM Tris-HCl,0.1%(v/v) Tween-20,pH7.5 |
洗脱缓冲液 Elution Buffer | 0.1M Glycine,0.1% (v/v) Tween-20,pH2.5 |
中和缓冲液 Neutralization Buffer | 1 M Tris-HCl, pH 9.0 |
1. 抗原样品制备
建议根据抗原样品的不同来源选择适当的预处理方式,以便将待检测抗原释放到样品溶液中。
1)血清样品:如果目标蛋白丰度较高,建议用Binding Buffer将血清样品稀释至目标蛋白终浓度为10~100 µg/mL,置于冰上备用,或于-20℃长期保存。
2)悬浮细胞样品:离心收集细胞(4℃, 500 g, 10 min),弃上清后称重,按每毫克细胞50 µL的比例用1× PBS洗涤两次。然后按每毫克细胞5~10 µL的比例加入Binding Buffer,同时加入蛋白酶抑制剂(1 mM PMSF 或蛋白酶抑制剂Cocktail C0001),混匀后置于冰上孵育10 min。离心收集上清液(4℃, 14000 g, 10 min),置于冰上备用,或于-20℃长期保存。
3)贴壁细胞样品:吸去培养基,按每1.0×10^5个细胞150 µL的比例用1×PBS洗涤两次。用细胞刮刀收集细胞,置于1.5 mL EP管,按每1.0×10^5个细胞20~30 µL的比例加入Binding Buffer,同时加入蛋白酶抑制剂,混匀后置于冰上孵育10 min。离心收集上清液(4℃, 14000 g, 10 min),置于冰上备用,或于-20℃长期保存。
4)大肠杆菌样品:离心收集大肠杆菌(4℃, 12000 g, 2 min),弃上清后称重,按每克(湿重)菌体10 mL的比例用1×PBS洗涤两次。然后按每克(湿重)菌体5~10 mL的比例加入Binding Buffer,同时加入蛋白酶抑制剂,重悬菌体,超声裂解细胞,离心收集上清(4℃, 17000 g, 10 min),置于冰上备用,或于-20℃长期保存。
注:以上方法制备的抗原样品适用于进行IP和Co-IP实验,如需进行ChIP实验,请另参照相关实验说明(如CST #9003)。
2. 磁珠预处理
1)将免疫沉淀磁珠用漩涡振荡器振荡1 min,使磁珠重新悬浮,取25~50 µL磁珠悬液放入1.5 mL EP管中。
2)加入200 µL Binding Buffer进行洗涤,将EP管放入磁性分离器,静置1 min,进行磁性分离,吸去上清液,取下EP管。重复上述洗涤步骤一次。
3)加入200 µL Binding Buffer重悬磁珠备用。
3. 抗体结合反应
1)抗体工作液的制备:将抗体样品用Binding Buffer稀释至终浓度为5~50 µg/mL,制备成抗体工作液,置于冰上备用。
2)抗体吸附:将步骤2中预处理的磁珠悬液进行磁性分离,吸去上清液。加入200 µL抗体工作液,迅速重悬磁珠,在室温下使用翻转混合仪或手工轻轻翻转EP管混合15 min,然后进行磁性分离,收集上清液,置于冰上备用以供后续检测。
3)洗涤:向EP管中加入200 µL Binding Buffer进行洗涤,轻轻用移液器吹打使磁珠-抗体复合物均匀分散,然后进行磁性分离,吸去上清液,取下EP管。重复上述洗涤步骤一次。
4. 抗体交联反应(可选操作)
如需同时洗脱抗体和目标抗原复合物,请跳过本步骤,直接进行步骤5。本步骤适用于需要单独洗脱目标抗原的实验,推荐使用BS3作为交联剂。具体实验操作请参照该试剂的说明书。
5. 抗原沉淀反应
1)抗原吸附:加入200 µL步骤1中制备的抗原样品,用移液器轻轻吹打,使抗原与磁珠-抗体复合物均匀分散。在室温下使用翻转混合仪或手工轻轻翻转EP管混合10 min,以确保抗原与抗体充分结合。如结合力较弱,可在室温下孵育1 h,或在4℃下孵育过夜。
2)洗涤与转移:将上述完成抗原吸附的磁珠-抗体-抗原复合物进行磁性分离,收集上清液,置于冰上以备后续检测。向EP管中加入200 µL Washing Buffer进行洗涤,用移液器轻轻吹打,使磁珠-抗体-抗原复合物均匀分散,然后进行磁性分离,吸去上清液,取下EP管。重复洗涤两次。最后,加入200 µL Washing Buffer,将磁珠-抗体-抗原复合物悬液转移至新的1.5 mL EP管中,并进行磁性分离,吸去上清液,取下EP管。
注:抗原洗脱前,需将磁珠转移到新的EP管,以避免将管壁上非特异性吸附的蛋白一同洗脱。
6. 抗原洗脱
提供以下两种抗原洗脱方案,用户可根据后续检测的需要选择不同的洗脱方法。
1)变性洗脱法:此方法洗脱的样品适用于SDS-PAGE检测。向EP管中加入25 µL 1× SDS-PAGE Loading Buffer(自备),混合均匀,95℃加热5 min。然后进行磁性分离或者离心(室温,13000 g, 10 min),收集上清液,进行SDS-PAGE检测。
2)非变性洗脱法:此方法洗脱的样品保持原有的生物活性,可用于后续功能分析。向EP管中加入20 µL Elution Buffer,混合均匀,室温孵育10 min。然后进行磁性分离或者离心(室温,13000 g, 10 min),收集上清液至新的EP管,并立即加入1.0 µL Neutralization Buffer,将洗脱产物pH调节至中性,用于后续功能分析。
4℃,2年。
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