Protein A/G Agarose

• 物理化学稳定性良好
• 配基不易脱落
• 耐用性强
• 使用便捷

• 蛋白质及蛋白质复合物的IP、Co-IP、ChIP和RIP。
• 抗体纯化。

一、缓冲液准备
以下为常用的缓冲液成分，使用前建议用 0.22 μm 或 0.45 um 滤膜过滤：
1)平衡/洗杂液：0.15 M NaCl, 20 mM Na2HPO4, pH7.0
2)酸性洗脱液：0.1 M glycine, pH3.0
3)中和液：1 M Tris-HCl, pH8.0

二、蛋白纯化
1. 抗体吸附
1)取适量的Protein A/G 琼脂糖凝胶加入2 mL离心管中，1000 rpm离心5 min，弃去上清。
2)加入0.5 mL平衡液，悬浮凝胶（确保凝胶与目标蛋白处于相同的缓冲体系中，保护蛋白），1000 rpm 离心5 min，弃去上清。重复此操作两次。
3)向平衡好的凝胶中加入抗体溶液，悬浮混合，室温下在翻转混合仪或手动轻轻翻转30 min，1000 rpm 离心5 min，收集上清液以备后续检测。
4)加入0.5 mL洗杂液，悬浮凝胶清洗以去除非特异性吸附的杂蛋白，1000 rpm离心5 min，弃去上清。重复两次。

2. 抗体交联（可选）
若需将抗体与抗原复合物共同洗脱，可跳过此步骤，直接进行下一步。对于50 μL-1 mL的凝胶量，以下步骤无需增加交联液体积。
1)向清洗后的凝胶中加入1 mL交联液（0.2 M三乙醇胺，pH 8.2），1000 rpm离心5 min，弃去上清。
2)加入1 mL含20 mM DMP（dimethyl pimelimidate dihydrochloride）的交联液，现用现配，悬浮凝胶并在室温下翻转混合30 min，1000 rpm离心5 min，弃去上清。
3)加入1 mL终止液（50 mM Tris，pH 7.5），悬浮凝胶，在室温下翻转混合15 min后，1000 rpm离心5 min，弃去上清以终止交联。
4)加入0.5 mL洗杂液，悬浮凝胶并清洗，1000 rpm离心5 min，弃去上清。重复两次。

3. 抗原沉淀反应
1)抗原吸附：将含抗原的样品加入到凝胶-抗体复合物中，用移液器轻轻混匀。在室温下翻转混合10 min，以便抗原与抗体充分结合。若结合力较弱，可延长至室温反应1 h，或在4℃下过夜反应。
2)洗杂：1000 rpm离心5 min收集上清液，冰上保存以备检测。加入1 mL洗杂液，轻轻混匀悬浮后离心1000 rpm 5 min，弃去上清。重复洗涤两次。最后将凝胶-抗体-抗原复合物悬浮转移至新的1.5 mL离心管，1000 rpm离心5 min，弃去上清。
3)抗原洗脱：提供两种洗脱方法，根据后续检测选择合适的方案。
a)变性洗脱法：适用于SDS-PAGE检测。加入25 μL 1×SDS-PAGE Loading Buffer，混匀后于95℃加热5 min。1000 rpm离心5 min，收集上清用于SDS-PAGE电泳及后续Western Blot分析。
b)非变性洗脱法：保持抗原生物活性，适用于功能分析。加入5倍柱体积的酸性洗脱液，用移液器轻轻吹打5次以混匀。室温下翻转混合10 min后，1000 rpm离心5 min，收集上清作为目标抗原，将洗脱组分转移至新管，立即加入1/10体积的中和液，将pH调至7.0-8.0，以便后续功能分析。

三、免疫沉淀
1. 抗原抗体结合
将抗体与含有目标蛋白的裂解液混合，在室温下轻微震荡孵育30-60 min，或在2-8℃环境下孵育过夜。具体孵育条件需根据抗原-抗体的结合效率和抗原的稳定性进行优化，以便形成稳定的抗原-抗体复合物。
注：抗体的加入量应根据后续凝胶的用量进行适当调整，过量的抗体可能会影响复合物与凝胶的结合效果，建议抗体用量不超过凝胶最大载量的80%。

2. 凝胶准备
1)取适量的Protein A/G 琼脂糖凝胶加入2 mL离心管中，1000 rpm离心5 min，弃去上清。
2)加入0.5 mL平衡液，悬浮凝胶（确保凝胶与目标蛋白处于相同的缓冲体系中，保护蛋白），1000 rpm 离心5 min，弃去上清。重复此操作两次。

3. 抗原-抗体复合物的吸附
将步骤1中制备的抗原-抗体复合物加入到已处理好的凝胶中，轻轻混合，在室温下翻转混合以确保充分接触并吸附，约30 min后，1000 rpm离心5 min，收集上清液以备后续检测。

4. 洗杂
加入0.5 mL洗杂液，轻轻悬浮凝胶进行洗涤，以去除非特异性吸附的杂蛋白。1000 rpm离心5 min，弃去上清，重复两次。

5. 抗原洗脱：
提供两种洗脱方法，根据后续检测选择合适的方案。
1)变性洗脱法：适用于SDS-PAGE检测。加入25 μL 1×SDS-PAGE Loading Buffer，混匀后于95℃加热5 min。1000 rpm离心5 min，收集上清用于SDS-PAGE电泳及后续Western Blot分析。
2)非变性洗脱法：保持抗原生物活性，适用于功能分析。加入5倍柱体积的酸性洗脱液，用移液器轻轻吹打5次以混匀。室温下翻转混合10 min后，1000 rpm离心5 min，收集上清作为目标抗原，将洗脱组分转移至新管，立即加入1/10体积的中和液，将pH调至7.0-8.0，以便后续功能分析。

4℃，2年。

1. 凝胶应保存在储存溶液中，防止干燥。
2. 在从保存管中取出琼脂糖凝胶之前，应充分震荡以确保均匀悬浮。操作过程中注意避免产生气泡。
3. 为确保最佳实验效果，请选择特异性较强的抗体进行免疫沉淀反应。
4. 在IP实验中，不同类型的抗体和抗原结合的亲和力会有所不同。因此，如果使用本说明书推荐的缓冲体系未能获得理想的实验结果，操作者可以自行筛选和配制缓冲液进行实验。
5. 本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
6. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。