Protein A Agarose

• 物理化学稳定性良好
• 配基不易脱落
• 耐用性强
• 使用便捷

• 从细胞裂解物、细胞分泌上清、血清、腹水等样品中对IgG进行分离纯化。
• 蛋白质及蛋白质复合物的IP、Co-IP、ChIP和RIP。

1. 缓冲液准备
以下为常用的缓冲液成分，使用前建议用 0.22 μm 或 0.45 um 滤膜过滤：
1)平衡/洗杂液：0.15 M NaCl, 20 mM Na2HPO4, pH7.0
2)酸性洗脱液：0.1 M glycine, pH3.0
3)中和液：1 M Tris-HCl, pH8.0

2. 样品准备
1)在上柱之前，应确保样品溶液的离子强度和pH值适当。可以使用平衡液或洗杂液对血清样品、腹水或细胞培养液进行稀释，或者通过透析将样品与平衡液或洗杂液进行平衡处理。
2)为了减少杂质、提高蛋白纯化效率并防止柱子堵塞，建议在上样前对样品进行离心处理或使用0.22 μm或0.45 μm滤膜进行过滤。

3. 琼脂糖凝胶装填：重力柱的装填
1)选择合适规格的重力层析柱，装入下垫片，加入适量纯水以润洗柱管和垫片，然后关闭下出口。
2)将琼脂糖凝胶充分混匀后，使用枪头吸取适量的悬液加入至重力柱中（凝胶实际体积占悬液的一半），打开下出口让保护液流尽。
3)加入适量纯水冲洗凝胶，待柱管中的液体通过重力流干后，关闭下出口。
4)装入已经润洗的上垫片，确保垫片与凝胶之间没有空隙，并保持水平。
5)装填完成的重力柱可以直接加入平衡液进行平衡。如果暂时不使用，可加入保护液并在2-8℃条件下保存。

4. 样品纯化
A. 重力柱法纯化
1)将装填好的琼脂糖凝胶重力柱用5倍柱体积的平衡液进行平衡，使凝胶与目标蛋白的缓冲液体系相同，重复2-3次。
2)将样品加入已平衡的重力柱中，确保样品在柱中至少保留2 min，以确保与凝胶充分接触。收集流出液，可以反复上样以增加结合效率。
3)用10-15倍柱体积的洗杂液进行清洗，去除非特异性吸附的杂蛋白，并收集洗杂液。
4)使用5-10倍柱体积的酸性洗脱液进行洗脱，分段收集洗脱液。每个柱体积收集一管，以检测洗脱效率，确保所有结合的目标蛋白被洗脱，同时获得高纯度和高浓度的蛋白。洗脱组分应立即调至中性，通常建议用1/10体积的中和液进行中和。
注：洗脱结束后，先用3倍柱体积的平衡液冲洗，再用5倍柱体积的纯水冲洗，随后用2倍柱体积的20%乙醇冲洗。最后，将凝胶存放于2-8℃下保存。

B. 孵育法纯化
1)根据待纯化样品的量，将琼脂糖凝胶充分混匀后，取适量加入离心管，1000 rpm离心5 min，弃去上清；也可以将其加入重力柱中，待保护液流尽。
2)向离心管中加入5倍凝胶体积的平衡液以清洗凝胶，1000 rpm离心5 min，弃去上清。如使用重力柱，直接在柱中清洗并流尽平衡液。此操作需重复两次以上。
3)加入样品，封闭离心管或重力柱，4°C振荡孵育2-4 h，或在37°C孵育30 min-2 h。
4)孵育结束后，1000 rpm离心5 min，弃去上清，或通过过滤收集凝胶。保留上清以作为流穿样用于电泳鉴定。
5)用5倍凝胶体积的洗杂液清洗凝胶，1000 rpm离心5 min，或在重力柱中过滤去除上清（注意不要吸到凝胶），重复3-5次，建议中途更换新的离心管。
6)加入3-5倍柱体积的酸性洗脱液进行洗脱，室温孵育5 min，1000 rpm离心5 min，或通过重力柱收集洗脱液。可重复2-3次。洗脱组分应立即调至中性，通常建议用1/10体积的中和液进行中和。

5. SDS-PAGE检测
使用SDS-PAGE对纯化过程中得到的样品（包括流出组分、洗杂组分和洗脱组分）以及原始样品进行检测，以评估纯化效果。

6. 凝胶清洗
琼脂糖凝胶可以重复使用而无需再生处理，但随着非特异性结合蛋白的增多和蛋白聚集，可能会导致流速和结合载量的下降。此时可以按照以下方法对凝胶进行清洗：
1)为去除沉淀或变性物质，建议使用2倍柱体积的6 M盐酸胍溶液进行清洗，随后立即用5倍柱体积的PBS（pH 7.4）进行清洗。
2)为去除因疏水性吸附而导致的非特异性吸附物质，可使用3-4倍柱体积的70%乙醇或2倍柱体积的1% Triton X-100进行清洗，之后立即用5倍柱体积的PBS（pH 7.4）进行清洗。

4℃，2年。

1. 凝胶应保存在储存溶液中，防止干燥。
2. 在从保存管中取出琼脂糖凝胶之前，应充分震荡以确保均匀悬浮。操作过程中注意避免产生气泡。
3. 本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
4. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。