Magrose Beads NTA-Nickel (Ultra-suspension)

• 粗样品无需预处理，可直接纯化目标蛋白，显著缩短纯化时间。
• 一步纯化即可获得高产率、高纯度的目标蛋白。
• 可自由调节目标蛋白的浓度和体积。
• 平行操作稳定性高，便于进行高通量和大规模蛋白纯化。
• 磁珠可重复使用，再生操作简单。

• 纯化细菌、酵母、昆虫和哺乳动物细胞等分泌或胞内表达的可溶性His标签蛋白。
• 纯化变性蛋白；包涵体需变性后再进行纯化。

1. 缓冲液准备
以下为常用的缓冲液成分，适用于多数His标签蛋白的纯化，使用时可根据需要进行调整。缓冲液在使用前最好使用0.22 μm或0.45 μm滤膜过滤除菌。
1)Binding Buffer：20 mM Phosphate Buffer，500 mM NaCl，5~50 mM Imidazole，pH7.4。
2)Washing Buffer：20 mM Phosphate Buffer，500 mM NaCl，50~100 mM Imidazole，pH7.4。
3)Elution Buffer：20 mM Phosphate Buffer，500 mM NaCl，500 mM Imidazole，pH7.4。

2. 蛋白样品处理
1)大肠杆菌、酵母等细胞内表达蛋白：用适量 Binding Buffer 稀释表达细胞，加入蛋白酶抑制剂（如1 mM PMSF或蛋白酶抑制剂Cocktail C0001），重悬细胞后冰浴超声裂解细胞，即得到粗蛋白样品。如果样品过于粘稠，可根据需要在粗样品中加入适量核酸酶，冰浴 30 min，以降解核酸。也可以根据实际需要对蛋白样品进行离心操作。
2)动物细胞胞内表达蛋白：取适量动物细胞，用适量 PBS 洗涤 1 次，吸去上清液，再用适量含 1%（v/v） Triton X-100 或 1%（v/v） NP-40 的 Binding Buffer 重悬，加入蛋白酶抑制剂，冰浴 10 min，即得到粗蛋白样品。
3)胞外表达蛋白：取胞外表达的上清液，用等量的 Binding Buffer 稀释，即得到粗蛋白样品。

3. 磁珠预处理
磁珠使用量需要根据目标蛋白产量和磁珠载量信息计算。例如，使用大肠杆菌表达某目标蛋白，500 mL的发酵液可收获2 g湿重的菌体，通过预实验估算其目标蛋白产量为10～20 mg，则需要取5 mL磁珠悬液用于目标蛋白的纯化。以此为例介绍操作步骤：
1)将His-tag 蛋白纯化磁珠用漩涡振荡器振荡充分混匀，然后使用移液器吸取5 mL磁珠悬液置于15 mL离心管中。将离心管放入磁性分离器，静置1 min，进行磁性分离，吸去上清液，取下离心管。
2)向离心管中加入5 mL Binding Buffer，温和翻转离心管数次，使磁珠重新悬浮。接着进行磁性分离，吸去上清液。重复洗涤步骤2次。

4. 磁珠与目标蛋白结合
1)使用10 mL Binding Buffer悬浮2 g湿重的菌体，进行破碎和裂解后得到目标粗蛋白样品。将其加入装有预处理磁珠的离心管中，并将离心管放置于漩涡混匀器中振荡15 s。
2)将离心管置于旋转混合仪上，室温下旋转混合20~30 min；或者为了防止目标蛋白降解，也可在2~8℃的低温环境下旋转混合1 h。
3)将离心管进行磁性分离，将上清液移至新的离心管中备用后续检测。取下离心管，进行后续的洗涤步骤。

5. 磁珠洗涤
1)向装有磁珠的离心管中加入10 mL Washing Buffer，温和翻转离心管数次，使磁珠重新悬浮，进行磁性分离。将清洗液移至新的离心管中备用，以备取样检测。重复洗涤步骤1次。
2)为避免原离心管壁上的非特异性吸附蛋白污染目标蛋白，向装有磁珠的离心管中加入10 mL Washing Buffer，使磁珠重新悬浮后，将磁珠悬液转移至新的离心管中，进行磁性分离，将上清液移至清洗液收集管中。

6. 目标蛋白洗脱
1)根据需要确定洗脱体积以调整目标蛋白浓度，加入2~10 mL Elution Buffer，温和翻转离心管数次，使磁珠重新悬浮，进行磁性分离。将洗脱液收集到新的离心管中，即得到纯化的目标蛋白样品。
2)为确保目标蛋白完全洗脱，可重复上述步骤1次。

7. 磁珠后处理
1)向装有磁珠的离心管中加入5 mL Elution Buffer，温和翻转离心管数次，使磁珠重新悬浮，进行磁性分离，吸去上清液。重复此步骤2次。
2)向离心管中加入5 mL ddH2O，温和翻转离心管数次，使磁珠重新悬浮，进行磁性分离，吸去上清液。重复此步骤2次。
3)向磁珠加入Storage Buffer，使总体积为5 mL，保存于2~30℃（长期保存时，置于2~8℃），可用于下一次同种蛋白的纯化。

8. 磁珠再生
磁珠连续使用超过三次，其结合目标蛋白的能力可能会显著下降，因此建议进行磁珠再生处理。以 5 mL 10%（v/v）磁珠悬液为例，介绍磁珠再生操作步骤：
1)自备试剂：
• Stripping Buffer：20 mM Sodium Phosphate，500 mM NaCl，100 mM EDTA， pH 7.4
• Beads Washing Buffer（可选）：0.5 M NaOH，2 M NaCl
• Recharge Buffer：100 mM NiSO4 / CoCl2 （有毒性，请注意防护）
• Storage Buffer：20%（v/v）Ethanol
2)对磁珠悬液进行磁性分离，吸去上清液，取下离心管，加入 5 mL ddH2O，温和翻转离心管数次，使磁珠重新悬浮，进行磁性分离，吸去上清液。
3)加入 5 mL Stripping Buffer，温和翻转离心管数次，使磁珠重新悬浮，室温下旋转混合 5 min，进行磁性分离，吸去上清液。重复此步骤1次。
4)加入 5 mL ddH2O，温和翻转离心管数次，使磁珠重新悬浮，进行磁性分离，吸去上清液。重复此步骤2次。
5)碱处理：加入 5 mL Beads Washing Buffer，温和翻转离心管数次，使磁珠重新悬浮，室温下旋转混合 5 min，进行磁性分离，吸去上清液。
6)加入 5 mL ddH2O，温和翻转离心管数次，使磁珠重新悬浮，进行磁性分离，吸去上清液。重复此步骤 3~5 次，直到洗涤液呈中性。
7)加入 5 mL Recharge Buffer，温和翻转离心管数次，使磁珠重新悬浮，室温下旋转混合 5 min，进行磁性分离，吸去上清液。
8)加入 5 mL ddH2O，温和翻转离心管数次，使磁珠重新悬浮，进行磁性分离，吸去上清液。重复此步骤4次以上，以确保完全去除镍离子。
9)最后，加入储存缓冲液至磁珠，总体积为 5 mL，保存于 2-30℃（长期保存时，置于2-8℃）。

9. 蛋白纯化流程的优化
上述操作流程适用于大多数His标签蛋白的纯化。根据目标蛋白与金属离子螯合磁珠的结合特性不同，用户对纯化流程进行优化，以提高目标蛋白的回收率和纯度。
1)提高目标蛋白回收率的参考方法：
• 降低样品溶液和Binding Buffer中的Imidazole浓度。
• 在样品溶液和其他缓冲液中添加表面活性剂等物质。
• 添加适当的蛋白酶抑制剂，防止目标蛋白降解。
• 增加磁珠的用量。
• 延长蛋白与磁珠孵育的时间。
• 延长目标蛋白洗脱的时间或增加洗脱次数。
2)提高目标蛋白纯度的参考方法：
• 提高样品溶液和Binding Buffer中的Imidazole和NaCl浓度。
• 在样品溶液和其他缓冲液中添加表面活性剂等物质。
• 添加适当的蛋白酶抑制剂，防止目标蛋白降解。
• 延长洗涤时间，增加洗涤次数。
• 采用梯度Imidazole浓度洗脱目标蛋白。

4℃，2年。

1. 避免对磁珠进行冷冻、干燥和高速离心等操作。
2. 为了减少磁珠的损失，每次磁性分离的时间不应少于1 min。
3. 从磁珠保存管中取出磁珠之前，应充分震荡以确保均匀悬浮。操作过程中注意避免产生气泡。
4. 建议使用质量较好的移液器吸头和反应管，以避免因磁珠和溶液附着而造成损失。
5. 磁珠与溶液混合过程中，如果溶液粘稠导致翻转离心管无法重悬磁珠，可以使用移液器吹打或瞬时漩涡混合，使磁珠充分重悬。
6. 用户可以根据实际需求保留经磁性分离后移去的上清液，并进行取样检测，以便分析纯化过程并优化蛋白纯化流程。
7. 本产品可以重复使用，当纯化性能降低时，建议进行再生处理。
8. 使用过的磁珠在重复使用时，建议继续纯化同种蛋白；如果要纯化不同种类的蛋白，建议使用新的磁珠。
9. 本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
10. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。