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规格 | 价格 | 库存 | 数量 |
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50 mL | ¥ 17,220 | 5日内发货 |
产品名称 | Mag Beads NHS (300 nm)(C0098) | Mag Beads NHS (2 μm)(C0100) | Magrose Beads NHS (10-30 μm)(C0102) | Magrose Beads NHS (30-150 μm)(C0103) |
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平均粒径 | 300 nm | 2 μm | 10-30 μm | 30-150 μm |
磁珠基材 | 聚合物 | 聚合物 | 琼脂糖 | 琼脂糖 |
配基 | N-羟基琥珀酰亚胺 | N-羟基琥珀酰亚胺 | N-羟基琥珀酰亚胺 | N-羟基琥珀酰亚胺 |
配基密度 | - | - | 20~30 µmol/mL 磁珠 | 20~30 µmol/mL 磁珠 |
结合能力* | ≥30 µg 兔 IgG/mg 磁珠 | ≥30 µg 兔 IgG/mg 磁珠 | 20~30 mg 兔 IgG/mL 磁珠 | 20~30 mg 兔 IgG/mL 磁珠 |
磁珠悬液浓度 | 10 mg/mL | 10 mg/mL | 20%(V/V) | 20%(V/V) |
保存溶液 | DMAC | DMAC | 无水异丙醇 | 无水异丙醇 |
*磁珠与配体的结合能力与生物配体的本身特性相关,此处仅为参考值。
试剂 | 可选配方 |
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Washing Buffer A | 1 mM盐酸,使用前预冷至4℃ |
Coupling Buffer A | 100 mM 2-吗啉乙磺酸MES,pH 4.8(用于等电点小于7的生物分子的偶联) |
Coupling Buffer B | 200 mM NaHCO3,pH 8.3(用于等电点大于7的生物分子的偶联) |
Blocking Buffer | 3 M乙醇胺,pH 9.0 |
Storage Buffer | 1×PBS,可根据需求添加0.1% proclin-300或0.05%叠氮化钠 |
注:
1. 磁珠洗涤
磁珠洗涤步骤应严格遵循说明书的指示,使用冷却的Washing Buffer A进行快速洗涤,以防止在洗涤过程中NHS基团发生水解,影响后续偶联效果。
2. 蛋白偶联中的Coupling Buffer选择
蛋白偶联时,首先需要通过实验筛选出合适的Coupling Buffer。可选择的缓冲液包括:Coupling Buffer A、Coupling Buffer B、50 mM 硼酸溶液(pH 8.5)、以及100 mM 磷酸缓冲液(含100 mM NaCl,pH 7.4)这四种。根据实验结果确定最适合的缓冲体系,以确保高效的偶联反应。
3. 蛋白浓度选择
在确定了合适的Coupling Buffer后,还需要调整蛋白溶液的浓度。蛋白浓度越高,偶联到磁珠上的蛋白量越大。这是因为NHS基团与蛋白的偶联反应和NHS基团的水解反应同时进行,需要找到最佳平衡点。当然,这要根据使用需求进行优化。如果只需要偶联少量蛋白,使用低浓度蛋白即可满足需求,从而降低成本。
4. 封闭步骤
在封闭步骤中,可以使用试剂盒提供的3 M乙醇胺,或选择Tris缓冲液(100 mM Tris-HCl,150 mM NaCl,pH 8.0)进行封闭,封闭时间不得少于2 h。如果化学封闭后背景信号依然较高,可以在封闭后额外添加BSA封闭步骤以进一步降低非特异性吸附。
以下为基于500 μL Mag Beads NHS磁珠样品的操作步骤,用户可根据实验需求按比例调整:
1. 蛋白溶液配制
1)用Coupling Buffer将待偶联蛋白溶解,配制成浓度为0.1-3.0 mg/mL的蛋白溶液(若使用Magrose Beads NHS,则浓度应≥3.0 mg/mL)。
2)对于已经储存在buffer中的蛋白,需先透析或脱盐,去除含伯氨基的物质后,再用Coupling Buffer配制蛋白溶液。
3)将配制好的蛋白溶液保存在4ºC备用。
注:
a)蛋白浓度≥2.0 mg/mL有助于提高偶联效率,需综合考虑成本与使用需求。
b)蛋白溶液中应避免含有带伯氨基的成分,如Tris、甘氨酸、明胶、BSA等。
2. 磁珠清洗
1)将磁珠用漩涡振荡器振荡充分混匀,然后使用移液器吸取500 µL磁珠悬液置于1.5 mL EP管中。
2)将EP管放入磁性分离器,静置1 min,进行磁性分离,吸去上清液,取下EP管。
3)向EP管中加入1 mL 2~8ºC的Washing Buffer A,涡旋混匀15 s。进行磁性分离,吸去上清液。
注:NHS基团易水解,应先预冷Washing Buffer A,再进行洗涤。
3. 蛋白质固定
1)向洗涤后的磁珠中立即加入500 μL蛋白溶液,涡旋混匀30 s。
注:需预先配制蛋白溶液,Washing Buffer A洗涤完毕后,应立即加入蛋白溶液进行偶联反应。
2)将EP管涡旋15 s,置于垂直混合仪上,室温混合2 h。为确保均匀反应,可在反应前30 min内,每5 min取下EP管涡旋混匀15 s。之后,每15 min取下EP管涡旋混匀15 s。
注:若需要,可以在4℃下过夜反应。
3)进行磁性分离,保留流穿液以备分析。
4. 磁珠封闭
1)向EP管中加入500 μL Blocking Buffer,涡旋30 s,进行磁性分离,吸去上清液。
2)重复上述封闭操作4次。
3)加入500 μL Blocking Buffer,涡旋混匀30 s,将EP管置于垂直混合仪上,室温反应2 h。
4)进行磁性分离,吸去上清液。
5)向EP管中加入1 mL超纯水,混合均匀后进行磁性分离,吸去上清液。
5. 磁珠保存
1)向EP管中加入1 mL Storage Buffer,充分混合,进行磁性分离,吸去上清液,重复此操作2次。
2)最后,加入500 μL Storage Buffer,混合均匀后,将磁珠储存在4ºC备用。
注:最终偶联蛋白的磁珠浓度为10 mg/mL(若使用Magrose Beads NHS,则为20% (V/V))。
4℃,1年。
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