His Tag Agarose NTA-Nickel

• 物理化学稳定性良好
• 配基不易脱落
• 耐用性强
• 使用便捷

• 纯化细菌、酵母、昆虫和哺乳动物细胞等分泌或胞内表达的可溶性His标签蛋白。
• 纯化变性蛋白；包涵体需变性后再进行纯化。

1. 缓冲液准备
以下为常用的缓冲液成分，适用于多数His标签蛋白的纯化，使用时可根据需要进行调整。缓冲液在使用前最好使用0.22 μm或0.45 μm滤膜过滤除菌。
1)Binding Buffer：20 mM Phosphate Buffer，500 mM NaCl，5~50 mM Imidazole，pH7.4。
2)Washing Buffer：20 mM Phosphate Buffer，500 mM NaCl，50~100 mM Imidazole，pH7.4。
3)Elution Buffer：20 mM Phosphate Buffer，500 mM NaCl，500 mM Imidazole，pH7.4。

2. 蛋白样品处理
1)大肠杆菌、酵母等细胞内表达蛋白：用适量 Binding Buffer 稀释表达细胞，加入蛋白酶抑制剂（如1 mM PMSF或蛋白酶抑制剂Cocktail C0001），重悬细胞后冰浴超声裂解细胞，即得到粗蛋白样品。如果样品过于粘稠，可根据需要在粗样品中加入适量核酸酶，冰浴 30 min，以降解核酸。也可以根据实际需要对蛋白样品进行离心操作。
2)动物细胞胞内表达蛋白：取适量动物细胞，用适量 PBS 洗涤 1 次，吸去上清液，再用适量含 1%（v/v） Triton X-100 或 1%（v/v） NP-40 的 Binding Buffer 重悬，加入蛋白酶抑制剂，冰浴 10 min，即得到粗蛋白样品。
3)胞外表达蛋白：取胞外表达的上清液，用等量的 Binding Buffer 稀释，即得到粗蛋白样品。

3. 纯化重组His标签融合蛋白
1)轻轻重悬His-tag 蛋白纯化琼脂糖凝胶 NTA-Ni，吸取2 mL凝胶至层析柱中，用10 mL Binding Buffer平衡凝胶。重复平衡步骤一次。
2)关闭层析柱下端出口，将制备好的含His标签蛋白的样品加入层析柱。盖紧柱上端口，用封口膜密封。将层析柱置于混匀仪上，在室温下孵育1-2 h，或置于2-8℃下孵育2-4 h或过夜。
3)孵育后，打开层析柱上下端口，让上清液完全流出。收集流穿液，存于2-8℃，以备后续检测。
4)向层析柱中加入10 mL Washing Buffer，收集洗杂液并存于2-8℃备用。重复洗涤步骤共4次。
5)蛋白洗脱
a)常规洗脱：加入1 mL Elution Buffer，用1.5 mL离心管收集洗脱液，每次收集5-10管。
注：如需优化洗脱步骤，也可采用梯度洗脱方式。
b)梯度洗脱：使用不同浓度的咪唑进行梯度洗脱，收集各级洗脱液。
注：在保存目标蛋白前，应进行透析或超滤，以去除咪唑等杂质。蛋白分装后，储存于-80℃冻存。

4. SDS-PAGE检测
使用SDS-PAGE对纯化过程中得到的样品（包括流出组分、洗杂组分和洗脱组分）以及原始样品进行检测，以评估纯化效果。

5. 凝胶再生
亲和纯化凝胶上的镍离子通常无需频繁剥离和重新挂载。当凝胶颜色变浅或载量显著下降时，应进行镍离子剥离和重新挂载，即凝胶再生。以下是具体操作流程：
1)将凝胶装填在合适的层析柱内
2)用5倍柱体积去离子水清洗凝胶。
3)用5倍柱体积的100 mM EDTA溶液（pH 8.0）剥离镍离子。
4)用10倍柱体积去离子水清洗凝胶。
5)加入5倍柱体积的0.5 M NaOH溶液，停留10-15 min。
6)用去离子水冲洗凝胶，直至洗出液的pH恢复中性。
7)用3-5倍柱体积的100 mM NiSO₄溶液进行镍离子挂载。
8)用10倍柱体积去离子水冲洗凝胶。
注：再生后的凝胶可立即使用。如需长期保存，将凝胶悬浮于等体积的20%乙醇溶液中，存放于4-30°C条件下备用。

4℃，2年 。

1. 避免冷冻本产品。
2. 凝胶应保存在储存溶液中，防止干燥。
3. 在从保存管中取出琼脂糖凝胶之前，应充分震荡以确保均匀悬浮。操作过程中注意避免产生气泡。
4. 本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
5. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

• C0147-His-tag 蛋白纯化琼脂糖凝胶 NTA-Ni说明书-中文(1.03 MB)