GST Tag Agarose

• 载量高
• 特异性好
• 性价比高

• 纯化不同表达系统中的GST标签融合重组蛋白。

1. 缓冲液准备
以下为常用的缓冲液成分，适用于多数GST融合蛋白的纯化，使用时可根据需要进行调整。缓冲液在使用前最好使用0.22 μm或0.45 μm滤膜过滤除菌。
1)Binding/Washing Buffer：140 mM NaCl，2.7 mM KCl，10 mM Na2HPO4，1.8 mM KH2PO4，pH 7.4。
2)Elution Buffer：50 mM Tris-HCl，10 mM 还原型谷胱甘肽，pH 8.0。
配制步骤：取50 mL 0.1 M Tris溶液，加入0.307 g还原型谷胱甘肽，然后用0.1 M 盐酸调整pH至8.0，最终用去离子水补至100 mL。可根据实验需求等比例缩放。
注：
a)还原型谷胱甘肽易氧化，Elution Buffer应现用现配，防止氧化，避免一次性全部溶解。
b)大多数GST融合蛋白使用含有10 mM还原型谷胱甘肽的Elution Buffer即可洗脱，对于结合能力强的GST融合蛋白，建议延长洗脱时间、增加洗脱次数，或提高谷胱甘肽浓度。
c)Binding/Washing Buffer和Elution Buffer可根据需要加入1-5 mM EDTA、1-10 mM DTT、0.1-1.0% Triton X-100或0.1-1.0% Tween 20，以提高蛋白稳定性。

2. 蛋白样品处理
1)大肠杆菌、酵母等细胞内表达蛋白：用适量Binding/Washing Buffer稀释表达细胞，加入蛋白酶抑制剂（如1 mM PMSF或蛋白酶抑制剂Cocktail C0001），重悬细胞后冰浴超声裂解细胞，即得到粗蛋白样品。如果样品过于粘稠，可根据需要在粗样品中加入适量核酸酶，冰浴30 min，以降解核酸。也可以根据实际需要对蛋白样品进行离心操作。
2)动物细胞胞内表达蛋白：取适量动物细胞，用适量PBS洗涤1次，吸去上清液，再用适量含1%（v/v） Triton X-100或1%（v/v） NP-40的Binding/Washing Buffer重悬，加入蛋白酶抑制剂，冰浴10 min，即得到粗蛋白样品。
3)胞外表达蛋白：取胞外表达的上清液，用等量的Binding/Washing Buffer稀释，即得到粗蛋白样品。

3. GST融合蛋白纯化
1)轻轻重悬GST Tag 琼脂糖凝胶。
2)吸取2 mL的琼脂糖凝胶加入层析柱中，使用10 mL Binding/Washing Buffer对凝胶进行平衡。重复此步骤一次。
3)关闭层析柱下端，将制备好的含GST标签蛋白的上清液倒入层析柱中，拧紧上端盖口，建议使用封口膜密封。将层析柱放在混匀仪上，室温孵育1-2 h；也可在2∽8℃下孵育2-4 h或过夜。
4)孵育结束后，打开层析柱的上下端口，待上清液完全流出后收集，作为流穿液，存放于2∽8℃备用，用于后续检测。
5)立即向层析柱中加入10 mL Binding/Washing Buffer，收集洗杂液，并存放于2∽8℃备用。重复此步骤四次。
6)加入1 mL Elution Buffer，用1.5 mL的离心管收集洗脱液。分别收集5∽10管。
7)将流穿液、洗杂液、洗脱液以及原始样品进行SDS-PAGE，检测纯化效果。
注：在保存目的蛋白之前，应进行透析或超滤以去除游离的谷胱甘肽，然后分装并冷冻保存于-80℃。

4. 凝胶清洗
GST Tag 琼脂糖凝胶可以重复使用而无需再生，但随着非特异性蛋白的累积和蛋白聚集，可能会导致流速减慢和结合能力下降。在这种情况下，需要对凝胶进行清洗。
1)去除沉淀或变性物质：使用2倍柱体积的6 M盐酸胍溶液进行清洗，随后立即用5倍柱体积的PBS（pH 7.4）进行清洗。
2)去除疏水性吸附导致的非特异性结合：用3-4倍柱体积的70%乙醇或2倍柱体积的1% Triton X-100进行清洗，之后立即用5倍柱体积的PBS（pH 7.4）进行清洗。

4℃，2年。

1. 凝胶应保存在储存溶液中，防止干燥。
2. 在从保存管中取出琼脂糖凝胶之前，应充分颠倒以确保均匀悬浮。操作过程中注意避免产生气泡。
3. 本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
4. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。