GFP Tag Magrose Beads

• 磁响应性快速
• 微球分散性优异
• 非特异性吸附极低
• 结合位点丰富

• 检测和纯化GFP、EGFP及其融合蛋白。
• 免疫沉淀（IP）、免疫共沉淀（Co-IP）实验。

一、缓冲液准备

以下为常用的缓冲液成分，适用于多数GFP融合蛋白的纯化，使用时可根据需要进行调整。缓冲液在使用前最好使用0.22 μm或0.45 μm滤膜过滤除菌。

1)Binding/Washing Buffer：50 mM Tris，0.15 M NaCl，pH7.4。
2)Elution Buffer：0.1 M Glycine-HCl, pH3.0。
3)Neutralization Buffer：1 M Tris-HCl, pH8.0。

二、GFP标签蛋白纯化

1. 磁珠预处理
1)将GFP Tag 琼脂糖磁珠用漩涡振荡器振荡充分混匀，然后使用移液器吸取适量磁珠悬液置于离心管中。将离心管放入磁性分离器，静置1 min，进行磁性分离，吸去上清液，取下离心管。
注：磁珠悬液用量需根据样品体积和所含样品含量计算。
2)向离心管中加入与磁珠悬液等量的Binding/Washing Buffer，振荡混匀，使磁珠重新悬浮。接着进行磁性分离，吸去上清液。重复洗涤步骤2次。
注：在进行磁性分离时，为了减少磁珠的损耗，当溶液变澄清后，应先盖紧离心管盖子，保持离心管放置在磁性分离器上。随后，手持磁性分离器与离心管一起上下翻转数次，使澄清的溶液冲刷掉离心管盖上残留的磁珠。静置片刻，待溶液再次变澄清后再进行后续操作。此步骤适用于后续的所有磁性分离过程。

2. 磁珠与目标蛋白结合
1)在预处理后的磁珠中加入样品溶液，并将离心管放置于漩涡混匀器中振荡15 s。
2)将离心管置于旋转混合仪上，室温下旋转混合30 min以上；或者为了防止目标蛋白降解，也可在2~8℃的低温环境下旋转混合1-2 h。
3)将离心管进行磁性分离，将上清液移至新的离心管中备用后续检测。取下离心管，进行后续的洗涤步骤。

3. 磁珠洗涤
1)向装有磁珠的离心管中加入5倍体积的Binding/Washing Buffer，旋转混合2 min，使磁珠重新悬浮，进行磁性分离。将清洗液移至新的离心管中备用，以备取样检测。重复洗涤步骤1次。
2)为避免原离心管壁上的非特异性吸附蛋白污染目标蛋白，向装有磁珠的离心管中加入Binding/Washing Buffer，使磁珠重新悬浮后，将磁珠悬液转移至新的离心管中，进行磁性分离，将上清液移至清洗液收集管中。

4. 目标蛋白洗脱
提供以下几种洗脱方案，用户可根据后续检测的需要选择不同的洗脱方法。
1)变性洗脱：此方法洗脱的样品适用于SDS-PAGE检测。向EP管中加入SDS-PAGE Loading Buffer（自备），混合均匀，95℃加热5 min。然后进行磁性分离，收集上清液，进行SDS-PAGE检测。
注：GFP Tag 琼脂糖磁珠变性洗脱后不可重复使用。
2)非变性洗脱：根据需要确定洗脱体积以调整目标蛋白浓度，加入3-5倍体积的Elution Buffer，室温旋转混合5-10 min，使磁珠重新悬浮，进行磁性分离。将洗脱液收集到新的EP管中，即得到目标蛋白。在洗脱液中加入相当于十分之一洗脱体积的Neutralization Buffer，将pH值调整至7.0-8.0。
注：酸性洗脱后，应立即使用Binding/Washing Buffer平衡磁珠，且GFP Tag 琼脂糖磁珠在洗脱液中停留时间不应超过20 min。

三、IP/Co-IP实验

1. 磁珠预处理
同蛋白纯化。

2. 磁珠与靶蛋白结合
1)向处理后的磁珠中加入含GFP标签的靶蛋白溶液，颠倒混匀。将离心管置于旋转混合仪上，室温下旋转混合30 min；或者为了防止目标蛋白降解，也可在2~8℃的低温环境下旋转混合1-2 h。
2)将离心管进行磁性分离，将上清液移至新的离心管中备用后续检测。取下离心管，加入5倍悬浮液体积的Binding/Washing Buffer，旋转混合2 min，使磁珠重新悬浮，进行磁性分离。重复洗涤步骤2次，即得到靶蛋白-磁珠复合物。
注：如果进行IP实验，跳过第3步，直接进行第4步。如果进行Co-IP实验，请继续进行第3步操作。

3. 目标蛋白与复合物结合
1)向上述GFP融合蛋白-磁珠复合物中加入含目标蛋白的裂解液。将离心管置于旋转混合仪上，室温下旋转混合30 min以上。
2)将离心管进行磁性分离，将上清液移至新的离心管中备用后续检测。取下离心管，加入5倍悬浮液体积的Binding/Washing Buffer，旋转混合2 min，使磁珠重新悬浮，进行磁性分离。重复洗涤步骤2次，即得到目标蛋白-靶蛋白-磁珠复合物。

4. 目标蛋白洗脱
提供以下几种洗脱方案，用户可根据后续检测的需要选择不同的洗脱方法。
1)变性洗脱：此方法洗脱的样品适用于SDS-PAGE检测。向EP管中加入SDS-PAGE Loading Buffer（自备），混合均匀，95℃加热5 min。然后进行磁性分离，收集上清液，进行SDS-PAGE检测。
注：GFP Tag 琼脂糖磁珠变性洗脱后不可重复使用。
2)非变性洗脱：根据需要确定洗脱体积以调整目标蛋白浓度，加入3-5倍体积的Elution Buffer，室温旋转混合5-10 min，使磁珠重新悬浮，进行磁性分离。将洗脱液收集到新的EP管中，即得到目标蛋白。在洗脱液中加入相当于十分之一洗脱体积的Neutralization Buffer，将pH值调整至7.0-8.0。
注：酸性洗脱后，应立即使用Binding/Washing Buffer平衡磁珠，且GFP Tag 琼脂糖磁珠在洗脱液中停留时间不应超过20 min。

4℃，2年。

1. 避免对磁珠进行冷冻、干燥和高速离心等操作。
2. 为了减少磁珠的损失，每次磁性分离的时间不应少于1 min。
3. 从磁珠保存管中取出磁珠之前，应充分震荡以确保均匀悬浮。操作过程中注意避免产生气泡。
4. 建议使用质量较好的移液器吸头和反应管，以避免因磁珠和溶液附着而造成损失。
5. 磁珠与溶液混合过程中，如果溶液粘稠导致翻转离心管无法重悬磁珠，可以使用移液器吹打或瞬时漩涡混合，使磁珠充分重悬。
6. 用户可以根据实际需求保留经磁性分离后移去的上清液，并进行取样检测，以便分析纯化过程并优化蛋白纯化流程。
7. 本产品可以重复使用。当使用过的磁珠在重复使用时，建议继续纯化同种蛋白；如果要纯化不同种类的蛋白，建议使用新的磁珠。
8. 本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
9. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。