GST Tag Magrose Beads

• 磁响应性快速
• 微球分散性优异
• 非特异性吸附极低
• 结合位点丰富

• 纯化不同表达系统中的 GST 标签融合重组蛋白。
• GST-tag 蛋白的 Pull-down 实验。

一、GST标签蛋白纯化

1. 缓冲液准备
以下为常用的缓冲液成分，适用于多数GST融合蛋白的纯化，使用时可根据需要进行调整。缓冲液在使用前最好使用0.22 μm或0.45 μm滤膜过滤除菌。
1)Binding/Washing Buffer：140 mM NaCl，2.7 mM KCl，10 mM Na2HPO4，1.8 mM KH2PO4，pH 7.4。
2)Elution Buffer：50 mM Tris-HCl，10 mM 还原型谷胱甘肽，pH 8.0。
配制步骤：取50 mL 0.1 M Tris溶液，加入0.307 g还原型谷胱甘肽，然后用0.1 M 盐酸调整pH至8.0，最终用去离子水补至100 mL。可根据实验需求等比例缩放。
注：
a)还原型谷胱甘肽易氧化，Elution Buffer应现用现配，防止氧化，避免一次性全部溶解。
b)大多数GST融合蛋白使用含有10 mM还原型谷胱甘肽的Elution Buffer即可洗脱，对于结合能力强的GST融合蛋白，建议延长洗脱时间、增加洗脱次数，或提高谷胱甘肽浓度。
c)Binding/Washing Buffer和Elution Buffer可根据需要加入1-5 mM EDTA、1-10 mM DTT、0.1-1.0% Triton X-100或0.1-1.0% Tween 20，以提高蛋白稳定性。

2. 蛋白样品处理
1)大肠杆菌、酵母等细胞内表达蛋白：用适量Binding/Washing Buffer稀释表达细胞，加入蛋白酶抑制剂（如1 mM PMSF或蛋白酶抑制剂Cocktail C0001），重悬细胞后冰浴超声裂解细胞，即得到粗蛋白样品。如果样品过于粘稠，可根据需要在粗样品中加入适量核酸酶，冰浴30 min，以降解核酸。也可以根据实际需要对蛋白样品进行离心操作。
2)动物细胞胞内表达蛋白：取适量动物细胞，用适量PBS洗涤1次，吸去上清液，再用适量含1%（v/v） Triton X-100或1%（v/v） NP-40的Binding/Washing Buffer重悬，加入蛋白酶抑制剂，冰浴10 min，即得到粗蛋白样品。
3)胞外表达蛋白：取胞外表达的上清液，用等量的Binding/Washing Buffer稀释，即得到粗蛋白样品。

3. 磁珠预处理
磁珠使用量需要根据目标蛋白产量和磁珠载量信息计算。例如，使用大肠杆菌表达某目标蛋白，250 mL的发酵液可收获1 g湿重的菌体，通过预实验估算其目标蛋白产量为5～10 mg，则需要取2 mL 50%的磁珠悬液用于目标蛋白的纯化。以此为例介绍操作步骤：
1)将GST Tag 琼脂糖磁珠用漩涡振荡器振荡充分混匀，然后使用移液器吸取10 mL磁珠悬液置于15 mL离心管中。将离心管放入磁性分离器，静置1 min，进行磁性分离，吸去上清液，取下离心管。
2)向离心管中加入5-10 mL Binding/Washing Buffer，振荡混匀，使磁珠重新悬浮。接着进行磁性分离，吸去上清液。重复洗涤步骤2次。
注：在进行磁性分离时，为了减少磁珠的损耗，当溶液变澄清后，应先盖紧离心管盖子，保持离心管放置在磁性分离器上。随后，手持磁性分离器与离心管一起上下翻转数次，使澄清的溶液冲刷掉离心管盖上残留的磁珠。静置片刻，待溶液再次变澄清后再进行后续操作。此步骤适用于后续的所有磁性分离过程。

4. 磁珠与目标蛋白结合
1)使用10 mL Binding/Washing Buffer悬浮1 g湿重的菌体，进行破碎和裂解后得到目标粗蛋白样品。将其加入装有预处理磁珠的离心管中，并将离心管放置于漩涡混匀器中振荡15 s。
2)将离心管置于旋转混合仪上，室温下旋转混合20~30 min；或者为了防止目标蛋白降解，也可在2~8℃的低温环境下旋转混合1 h。
3)将离心管进行磁性分离，将上清液移至新的离心管中备用后续检测。取下离心管，进行后续的洗涤步骤。

5. 磁珠洗涤
1)向装有磁珠的离心管中加入5-10 mL Binding/Washing Buffer，旋转混合2 min，使磁珠重新悬浮，进行磁性分离。将清洗液移至新的离心管中备用，以备取样检测。重复洗涤步骤1次。
2)为避免原离心管壁上的非特异性吸附蛋白污染目标蛋白，向装有磁珠的离心管中加入5-10 mL Binding/Washing Buffer，使磁珠重新悬浮后，将磁珠悬液转移至新的离心管中，进行磁性分离，将上清液移至清洗液收集管中。

6. 目标蛋白洗脱
1)根据需要确定洗脱体积以调整目标蛋白浓度，加入2-5 mL Elution Buffer，室温旋转混合2 min，使磁珠重新悬浮，进行磁性分离。将洗脱液收集到新的离心管中，即得到纯化的目标蛋白样品。
2)为确保目标蛋白完全洗脱，可重复上述步骤1次，再次收集样品于新的离心管中，以检测目标蛋白是否完全洗脱。

7. 磁珠清洗和保存
磁珠在使用后可进行简单清洗处理，继续用于后续的纯化操作，或长期保存。根据磁珠使用的情况，用户可选择不同的清洗方法，以下为几种常见的处理方式：
A. 重复使用次数较少，结合能力未明显下降
此时可使用高pH和低pH的缓冲液交替洗涤磁珠：
1)高pH清洗（碱洗）：将使用后的磁珠加入10 mL Alkalinity Buffer（0.1 M Tris-HCl，0.5 M NaCl，pH 8.5），漩涡振荡60 s，进行磁性分离，吸去上清液。
2)低pH清洗（酸洗）：加入10 mL Acidity buffer（0.1 M 醋酸钠，0.5 M NaCl，pH 4.5），漩涡振荡60 s，进行磁性分离，吸去上清液。
3)重复上述碱洗和酸洗的步骤2次，共进行3次交替清洗。
B. 重复使用次数较多，结合能力显著下降
此时由于沉淀、变性或非特异性吸附蛋白的累积，磁珠的结合能力下降，需要去除沉淀或变性蛋白：
1)使用5 mL 6 M盐酸胍洗涤2次，每次漩涡振荡60 s，进行磁性分离，吸去上清液。
2)使用10 mL 1×PBS洗涤3次，每次漩涡振荡60 s，进行磁性分离，吸去上清液。
C. 去除疏水性吸附物质
1)使用5 mL 70%乙醇或0.1%非离子型表面活性剂溶液洗涤3次，每次漩涡振荡60 s，进行磁性分离，吸去上清液。
2)使用10 mL 1×PBS洗涤3次，每次漩涡振荡60 s，进行磁性分离，吸去上清液。
注：在完成A或B的清洗操作后，若继续使用磁珠用于蛋白纯化，需用Binding/Washing Buffer洗涤2-3次。若不需继续使用，则需用20%乙醇洗涤磁珠2-3次，之后将20%（V/V）乙醇加入磁珠中，最终体积调至10 mL，保存于2~8°C。

8. 蛋白纯化流程的优化
上述操作流程适用于大多数GST融合蛋白的纯化。根据目标蛋白与GST融合蛋白纯化磁珠的结合性能不同，用户对纯化流程进行优化，以提高目标蛋白的回收率和纯度。
A. 提高目标蛋白回收率的参考方法：
• 延长蛋白溶液与磁珠的孵育时间。
• 在样品和缓冲液中添加1~10 mM的DTT，可增强部分GST融合蛋白与磁珠的结合效果。
• 添加适当的蛋白酶抑制剂，防止目标蛋白降解。
• 增加磁珠的用量。
• 延长洗脱目标蛋白的时间或增加洗脱次数。
• 使用新鲜配制的Elution Buffer，确保目标蛋白的洗脱效率。
B. 提高目标蛋白纯度的参考方法：
• 避免剧烈的超声破碎，以防GST标签与目标蛋白发生断裂。
• 在样品溶液和缓冲液中添加0.1%的Tween 20或2%的NP-40，以减少非特异性蛋白的吸附。
• 添加适当的蛋白酶抑制剂，防止目标蛋白降解。
• 延长洗涤时间，增加洗涤次数。
• 使用梯度浓度的还原型谷胱甘肽进行目标蛋白洗脱。

二、蛋白Pull-Down实验

1. 缓冲液准备
同蛋白纯化。

2. 磁珠预处理
1)将GST Tag 琼脂糖磁珠用漩涡振荡器振荡充分混匀，然后使用移液器吸取100 μL磁珠悬液置于1.5 mL EP管中。进行磁性分离，吸去上清液，取下离心管。
2)向EP管中加入500 μL Binding/Washing Buffer，振荡混匀，使磁珠重新悬浮。接着进行磁性分离，吸去上清液。重复洗涤步骤2次。

3. 磁珠与靶蛋白结合
1)向处理后的磁珠中加入500 μL含GST标签的靶蛋白溶液。将EP管置于旋转混合仪上，室温下旋转混合20~30 min；或者为了防止蛋白降解，也可在2~8℃的低温环境下旋转混合1 h。
2)将EP管进行磁性分离，取下EP管。向装有磁珠的EP管中加入1 mL Binding/Washing Buffer，旋转混合2 min，使磁珠重新悬浮，进行磁性分离。重复洗涤步骤2次，即得到靶蛋白-磁珠复合物。

4. 目标蛋白与复合物结合
1)向上述GST融合蛋白-磁珠复合物中加入500 μL含目标蛋白的裂解液。将EP管置于旋转混合仪上，室温下旋转混合20~30 min。
2)将EP管进行磁性分离，将上清液移至新的EP管中备用后续检测。取下EP管，加入1 mL Binding/Washing Buffer，旋转混合2 min，使磁珠重新悬浮，进行磁性分离。重复洗涤步骤2次，即得到目标蛋白-靶蛋白-磁珠复合物。

5. 目标蛋白洗脱
提供以下几种抗原洗脱方案，用户可根据后续检测的需要选择不同的洗脱方法。
1)变性洗脱：此方法洗脱的样品适用于SDS-PAGE检测。向EP管中加入100 μL SDS-PAGE Loading Buffer（自备），混合均匀，95℃加热5 min。然后进行磁性分离，收集上清液，进行SDS-PAGE检测。
2)非变性洗脱：根据需要确定洗脱体积以调整目标蛋白浓度，加入200-500 μL Elution Buffer，室温旋转混合2 min，使磁珠重新悬浮，进行磁性分离。将洗脱液收集到新的EP管中，即得到GST融合蛋白与目标蛋白的复合物样品。

4℃，2年。

1. 避免对磁珠进行冷冻、干燥和高速离心等操作。
2. 为了减少磁珠的损失，每次磁性分离的时间不应少于1 min。
3. 从磁珠保存管中取出磁珠之前，应充分震荡以确保均匀悬浮。操作过程中注意避免产生气泡。
4. 建议使用质量较好的移液器吸头和反应管，以避免因磁珠和溶液附着而造成损失。
5. 磁珠与溶液混合过程中，如果溶液粘稠导致翻转离心管无法重悬磁珠，可以使用移液器吹打或瞬时漩涡混合，使磁珠充分重悬。
6. 用户可以根据实际需求保留经磁性分离后移去的上清液，并进行取样检测，以便分析纯化过程并优化蛋白纯化流程。
7. 本产品可以重复使用。当使用过的磁珠在重复使用时，建议继续纯化同种蛋白；如果要纯化不同种类的蛋白，建议使用新的磁珠。
8. 本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
9. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。